基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選及克隆棉花抗黃萎病相關(guān)基因.pdf

1、棉花黃萎病嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，阻礙了我國(guó)棉花的生產(chǎn)發(fā)展。隨著分子生物學(xué)和基因工程的快速發(fā)展，利用生物技術(shù)研究棉花抗黃萎病機(jī)制和克隆與棉花抗黃萎病相關(guān)基因已經(jīng)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。本研究利用本課題已構(gòu)建的黃萎病菌誘導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合在棉花D基因組中鑒定的抗病R基因篩選出與棉花抗黃萎病相關(guān)的候選抗病基因，并通過(guò)熒光定量PCR分析其在黃萎病菌誘導(dǎo)后的表達(dá)趨勢(shì)。從候選抗病基因中選擇兩個(gè)GbDRP66319和GbHIR42734進(jìn)行基因

2、克隆、生物信息學(xué)分析，并通過(guò)VIGS技術(shù)初步驗(yàn)證其功能。研究結(jié)果如下：
　　1、在本課題已經(jīng)獲得與棉花抗黃萎病性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記兩端800kb范圍內(nèi)尋找含有NBS-LRR類R基因共64個(gè)，以R基因比對(duì)黃萎病菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得與之高度同源的Unigenes，從中選擇顯著差異表達(dá)的24個(gè)Unigenes進(jìn)行熒光定量PCR，其在黃萎病菌誘導(dǎo)后的表達(dá)趨勢(shì)，結(jié)果顯示黃萎病菌誘導(dǎo)后相比對(duì)照表達(dá)量總體呈上調(diào)，但是不同基因的表達(dá)模式又

3、存在差異。大致可總結(jié)為兩種情況:一種是誘導(dǎo)4h后上調(diào)表達(dá)，即瞬時(shí)基礎(chǔ)防御;另一種情況是在誘導(dǎo)12h后上調(diào)表達(dá)，即滯后特異性防御。
　　2、本文通過(guò)同源基因克隆法，對(duì)GbDRP66319和GbHIR42734的編碼區(qū)進(jìn)行克隆，測(cè)序結(jié)果顯示GbDRP66319基因的CDS編碼區(qū)為879 bp，編碼292個(gè)氨基酸。通過(guò)TMHMM軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域，該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。GbDRP66319與棉花A和D基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得29個(gè)同源基因

4、，根據(jù)SMART等軟件分析保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示其含有P-loop，Kinase2，Kinase3，GLPL and MHDL五個(gè)motifs，以及LRR BAC，LRR CC和LRR TYP等抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域。GbHIR42734 CDS編碼區(qū)為855 bp，編碼284個(gè)氨基酸。通過(guò)TMHMM軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域，該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。GbHIR42734與棉花A和D基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得6個(gè)同源基因，該類蛋白均含有植物過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)的

5、家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域SPFH(Stomatins、Prohibitin、Flo-tillins、Hflk/C)結(jié)構(gòu)域和PHB(Prohibitin homologues)。
　　3、對(duì)GbDRP66319和GbHIR42734進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GbDRP66319在黃萎病菌誘導(dǎo)12h后抗病品種的下胚軸和子葉中的表達(dá)量顯著高于感病品種，并在抗病品種各組織中下胚軸表達(dá)量顯著最高。GbHIR42734在黃萎病菌誘導(dǎo)12h后的抗