棉花抗黃萎病基因篩選及NBS--LRR類抗病基因GbaNA1功能研究.pdf

1、棉花黃萎病是一種毀滅性土傳維管束真菌病害，被稱作棉花的“癌癥”。黃萎病病原菌侵染棉花后會(huì)引起葉片失綠變黃，萎蔫脫落，嚴(yán)重威肋棉花產(chǎn)量及纖維品質(zhì)。目前針對(duì)棉花抗黃萎病的分子機(jī)制及抗病基因功能研究，是棉花抗黃萎病研究的熱點(diǎn)問題。
　　本研究對(duì)二倍體棉種雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)侵染棉花轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出棉花抗黃萎病候選位點(diǎn)。對(duì)其中一

2、個(gè)抗病位點(diǎn)VdRL08編碼基因進(jìn)行了表達(dá)模式以及病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)分析，確定了該位點(diǎn)中候選抗病基因，在此基礎(chǔ)上克隆候選抗病基因并對(duì)基因功能進(jìn)行了鑒定。獲得了以下主要研究結(jié)果:
　　1.雷蒙德氏棉基因組共編碼1004個(gè)抗性基因同源序列(Resistance gene analogues，RGAs)，這些RGA基因之間具有很高的同源性。近一半的RGA基因成簇分布，共

3、形成26個(gè)基因簇(RGA-gene-rich clusters，Rgrcs)。同源性分析表明Rgrcs基因在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)和序列交換，不同Rgrcs基因之間存在片段轉(zhuǎn)移復(fù)制。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，RGA基因在棉花應(yīng)答大麗輪枝菌侵染過程中被誘導(dǎo)表達(dá)，接種大麗輪枝菌Vd991后從19個(gè)Rgrcs中共檢測到26個(gè)黃萎病抗性位點(diǎn)（Verticillium dahliae response loci，VdRLs）。12個(gè)VdRLs與已

4、知黃萎病抗性QTLs相鄰，其中5個(gè)VdRLs富含具有NB-ARC結(jié)構(gòu)域的NBS-LRR類抗病基因。
　　2.VdRL08是富含NBS-LRR類抗病基因的候選黃萎病抗性位點(diǎn)，該位點(diǎn)在雷蒙德氏棉中共編碼21個(gè)基因，8個(gè)基因?yàn)镹BS-LRR類抗病基因。該位點(diǎn)的基因在抗病海島棉和感病陸地棉中受到大麗輪枝菌侵染后具有不同的表達(dá)模式。PCR檢測結(jié)果表明該位點(diǎn)中編碼基因在海島棉7124(Gossypium barbadense L.var.Ha

5、i7124)中5個(gè)基因表現(xiàn)為缺失。對(duì)位點(diǎn)中其余16個(gè)基因進(jìn)行VIGS沉默后分析，發(fā)現(xiàn)只有GbaNA1基因沉默后棉花對(duì)黃萎病的抗性顯著降低，表明GbaNA1基因?yàn)闈撛邳S萎病抗病基因。
　　3.GbaNA1基因序列長度為2856 bp，編碼945個(gè)氨基酸，Blast比對(duì)結(jié)果表明該基因?qū)儆贜BS-LRR類抗病基因。GbaNA1受到茉莉酸和乙烯的誘導(dǎo)后強(qiáng)烈表達(dá)，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GbaNA1編碼蛋白定位于細(xì)胞核。將GbaNA1基因?qū)氲綌M

6、南芥野生型Col-0中，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)黃萎病的抗性顯著提高;該基因異源回補(bǔ)能夠恢復(fù)擬南芥AT4G27220.1（GbaNA1直系同源基因）缺失突變體na1黃萎病抗病能力，表明GbaNA1基因具有抗黃萎病功能。GbaNA1轉(zhuǎn)基因擬南芥受到大麗輪枝菌侵染后活性氧爆發(fā)較野生型Col-0和突變體na1顯著增強(qiáng);同時(shí)乙烯信號(hào)途徑相關(guān)基因在GbaNA1轉(zhuǎn)基因株系接種大麗輪枝菌后顯著誘導(dǎo)表達(dá)，表明GbaNA1調(diào)控乙烯信號(hào)參與抗病反應(yīng)。
　　4.從

7、18份棉花材料（海島棉和陸地棉各9份）中克隆GbaNA1同源基因，序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)陸地棉中GbaNA1同源基因在713 bp處插入了一個(gè)A堿基，導(dǎo)致了翻譯的提前終止（終止密碼子位置為757-759 bp TGA），CDS全長為759 bp，只編碼252個(gè)氨基酸。將GbaNA1基因在感病陸地棉軍棉1號(hào)中的同源基因GhNA1基因?qū)氲綌M南芥野生型Col-0中，接種大麗輪枝菌后轉(zhuǎn)基因株系對(duì)黃萎病的抗性未見提高，表明GhNA1基因喪失了對(duì)黃萎病

8、的抗性。
　　綜上所述，棉花基因組的RGA基因形成了典型的抗病基因簇(Rgrcs)，在雷蒙德氏棉中共發(fā)現(xiàn)了26個(gè)Rgrcs，且存在26個(gè)響應(yīng)大麗輪枝菌的抗性位點(diǎn)VdRLs。對(duì)包含NBS-LRR類抗病基因簇的抗性位點(diǎn)VdRL08研究發(fā)現(xiàn)，其中的GbaNA1是潛在的黃萎病抗病基因。該基因可以提高擬南芥對(duì)黃萎病的抗性及回補(bǔ)擬南芥直系同源基因AT4G27220.1的抗病功能;多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)G baNA1在感病陸地棉的等位基因發(fā)生了提前終止