棉花谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶亞基編碼基因GhGST的抗黃萎病功能研究.pdf

1、棉花是重要的纖維、油料作物，生產(chǎn)中常因黃萎病發(fā)生而使其產(chǎn)量大幅降低，品質(zhì)嚴(yán)重下降。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳維管束病害，實(shí)踐證明棉花抗病品種培育是生產(chǎn)上防治黃萎病最經(jīng)濟(jì)、高效和環(huán)保的方法，而克隆抗病基因、解析黃萎病抗性機(jī)制是抗病分子改良的基礎(chǔ)。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期克隆的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶亞基編碼基因GhGST為基礎(chǔ)，通過(guò)在不同抗感棉花品種中分析該基因的組織特異性表達(dá)，結(jié)合黃萎病菌脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的超表達(dá)試驗(yàn)和陸地棉抗病品種農(nóng)大601

2、的沉默試驗(yàn)，明確GhGST在棉花抗黃萎病中的作用，初步解析該基因的抗病機(jī)制，為棉花抗病遺傳改良提供基因資源，主要研究結(jié)果如下:
　　1.qRT-PCR分析表明，黃萎病菌誘導(dǎo)下GhGST在抗病品種農(nóng)大601根中的表達(dá)高于感病品種CCRI8，并且在接菌后12h表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因參與棉花與黃萎病菌的互作。
　　2.黃萎病菌脅迫下，轉(zhuǎn)GhGST基因煙草植株抗病表型較對(duì)照抗性明顯增強(qiáng);通過(guò)病菌分離試驗(yàn)分離植株體內(nèi)黃萎病菌，超表達(dá)植

3、株體內(nèi)病菌侵入量明顯少于野生型;轉(zhuǎn)GhGST基因煙草體內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)中與活性氧微平衡有關(guān)的H2O2含量、CAT和POD活性高于野生型，說(shuō)明GhGST在煙草體內(nèi)的表達(dá)增強(qiáng)了植株在抵抗黃萎病菌時(shí)體內(nèi)ROS物質(zhì)的微平衡，從而提高植株的抗病性。
　　3.構(gòu)建了GhGST沉默載體GhGST-pTRV2，采用葉片注射法沉默抗病品種農(nóng)大601中GhGST基因。黃萎病菌脅迫下GhGST-VIGS植株黃萎病抗性較空載體對(duì)照顯著下降;黃萎病菌脅迫下

4、的植株根系分析發(fā)現(xiàn)，空載體對(duì)照植株根系明顯比GhGST-VIGS植株根系要發(fā)達(dá);病菌分離試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GhGST-VIGS植株分離出大量的大麗輪枝菌菌絲，而對(duì)照組只有很少的大麗輪枝菌菌絲被分離出，同時(shí)GhGST-VIGS植株莖部維管束褐化程度也明顯較對(duì)照植株嚴(yán)重;體內(nèi)H2O2含量及CAT和POD活性顯著低于對(duì)照，說(shuō)明GhGST基因的表達(dá)對(duì)調(diào)節(jié)ROS平衡關(guān)鍵物質(zhì)H2O2含量、CAT和POD表達(dá)量的提高具有促進(jìn)作用，進(jìn)而增強(qiáng)了棉株的黃萎病抗性。

5、
　　4.構(gòu)建了超表達(dá)載體pCA-GhGST并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花莖尖轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化陸地棉感病品種Coker312，得到了132棵再生植株，通過(guò)GUS染色初步篩選得到36棵轉(zhuǎn)化植株，進(jìn)一步通過(guò)跨載體引物PCR檢測(cè)和產(chǎn)物測(cè)序最終檢測(cè)出11株陽(yáng)性苗，說(shuō)明GhGST基因已成功轉(zhuǎn)入受體基因組中，得到了T1代轉(zhuǎn)基因棉花，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到8.3％。為后續(xù)研究GhGST基因功能提供了重要的基礎(chǔ)材料。
　　綜合以上結(jié)果，本