棉鈴蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)表達(dá)及其基因克隆.pdf

1、該論文以棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Hubner)為對象,對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)反應(yīng)的最適條件、植物次生物質(zhì)和殺蟲藥劑對GSTs的體外抑制作用、GSTs在棉鈴蟲不同組織器官中的表達(dá)差異、植物次生物質(zhì)對GSTs誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了研究.并對GSTs進(jìn)行了部分純化及同功酶分析,對GSTs基因進(jìn)行了克隆和序列分析.棉鈴蟲中腸GSTs的最適pH值為7.5~9,而脂肪體為9;中腸GSTs的最適反應(yīng)溫度為50℃,而脂肪體GS

2、Ts為45℃;酶含量過大(總蛋白含量>60μg/ml)對GSTs酶促反應(yīng)有一定程度的抑制作用;谷胱甘肽(GSH)和1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)濃度過高(GSH>8mM,CDNB>2mM)對酶促反應(yīng)具有抑制作用.單寧酸、槲皮素和蕓香苷三種植物次生物質(zhì)對棉鈴蟲GSTs的CDNB軛合活性具有很強的抑制作用,但單寧酸與CDNB為競爭性抑制,槲皮素為非競爭性抑制,而蕓香苷為混合性抑制.在0.1mM的濃度下,有機磷和氨基甲酸酯類藥劑對棉鈴蟲

3、GSTs的抑制率在20-35％之間,而擬除蟲菊酯則幾乎沒有抑制作用.抑制率隨抑制劑濃度的增加而增大.棉鈴蟲GSTs在不同組織的表達(dá)差異很大.中腸、脂肪體、頭部和體壁的酶比活力分別為554.9、412.6、286.6和150.5nmol/mg pro./min.與室內(nèi)敏感種群相比,田間種群中中腸GSTs的比活力增加了66％,但脂肪體GSTs活性沒有顯著差異.棉鈴蟲不同組織、不同種群的GSTs對CDNB和GSH的親和力都沒有顯著差別.用2-

4、十三烷酮、槲皮素和單寧酸誘導(dǎo)48h后,棉鈴蟲中腸GSTs的比活力都有不同程度增加,而脂肪體GSTs的比活力都有所降低;它們與底物的親和力都沒有明顯改變,內(nèi)源性GSH的含量也沒有明顯變化.表明三種植物次生物質(zhì)對棉鈴蟲GSTs的誘導(dǎo)主要是引起GSTs的表達(dá)量改變,可能沒有引起同功酶組成的變化.從1齡初孵幼蟲開始用0.005％的單寧酸處理棉鈴蟲幼蟲,對5齡和6齡幼蟲GSTs的活性有明顯的抑制作用,比活力分別為對照的0.59和0.67倍.低劑量

5、、短時間處理,可誘導(dǎo)棉鈴蟲幼蟲中腸和脂肪體中GSTs的活性增加,高劑量或低劑量長時間處理沒有誘導(dǎo)增加作用,甚至還有抑制作用.單寧酸連續(xù)處理4代,對中腸GSTs均表現(xiàn)抑制作用,對脂肪體GSTs無顯著影響或有抑制作用.用GSH-Sepharose 4B親和層析柱一步法純化,獲得了純度較高的GSTs,SDS-PAGE和PAGE結(jié)果顯示,棉鈴蟲中腸含有3個GST同功酶,而脂肪體則有5個同功酶,它們亞基的分子量相同或相似,約30kD.單寧酸處理對