棉鈴蟲HaCHS和CDA基因的克隆、表達(dá)及FeedingRNAi分析.pdf

1、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）是棉花的重要害蟲，采用種植Bt棉和化學(xué)方法進(jìn)行防治導(dǎo)致害蟲出現(xiàn)抗性等一系列問題。RNAi技術(shù)因具有特異和高效的特點(diǎn)，而成為新型的害蟲防治策略。靶基因的選擇是成功的重要關(guān)鍵之一。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和圍食膜的主要成分之一，植物和高等動(dòng)物中不存在；其代謝是昆蟲的重要生化代謝過程之一。因此幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因有可能是RNAi技術(shù)防治害蟲的理想靶標(biāo)，具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究以棉鈴蟲體內(nèi)的幾丁質(zhì)代謝相

2、關(guān)基因CHS和CDA作為靶標(biāo)基因，對(duì)其進(jìn)行基因克隆和表達(dá)特征分析，并采用RNAi技術(shù)對(duì)其表型進(jìn)行分析。從而為實(shí)現(xiàn)棉鈴蟲的有效控制提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴棉鈴蟲幾丁質(zhì)合酶基因的克隆與表達(dá)分析⑼通過RT-PCR技術(shù)首次在棉鈴蟲克隆出兩個(gè)幾丁質(zhì)合酶基因：HaCHS1和HaCHS2；并得到了HaCHS1的兩個(gè)剪接變體，分別命名為HaCHS1A和HaCHS1B。HaCHS1的兩個(gè)交替外顯子序列，只有177bp的差異，核苷酸

3、和氨基酸水平上相似度分別為64％和69%。HaCHS1讀碼框4698 bp，編碼1565個(gè)氨基酸；HaCHS2讀碼框4587bp，編碼l528個(gè)氨基酸。RT-qPCR結(jié)果顯示：HaCHS2只在腸道表達(dá)，在前腸中表達(dá)量最高，其次是中腸和后腸，而在其他組織則表達(dá)量極低；HaCHS1A主要在表皮中高表達(dá)，前腸和后腸也檢測(cè)到少量的表達(dá)，而HaCHS1B在表皮，前腸和后腸中都高表達(dá)。HaCHS1A和HaCHS1B在幼蟲期，蛹期和蛾期都有表達(dá)，其中

4、蛹期表達(dá)量最高；而HaCHS2基因在卵期和幼蟲期表達(dá)量高。⑵棉鈴蟲幾丁質(zhì)脫乙酰基酶2基因的克隆與表達(dá)分析⑼克隆了棉鈴蟲四個(gè)幾丁質(zhì)脫乙?；富颍℉aCDA1，HaCDA2，HaCDA5a和HaCDA5b），其中HaCDA2為新基因，該基因ORF為1611 bp，編碼536個(gè)氨基酸，推測(cè)的蛋白分子量約為60.78 kDa，理論等電點(diǎn)為5.31。基于序列比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育確認(rèn)HaCDA2基因?qū)儆趲锥≠|(zhì)脫乙?；?家族。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：

5、HaCDA2基因只在脂肪體高表達(dá)；HaCDA2基因在幼蟲期和蛹期表達(dá)量高。⑶目的基因RNAi干擾效率檢測(cè)及表型觀察。分別構(gòu)建表達(dá)HaCHS、HaCDA的dsRNA的載體；用表達(dá)dsRNA（HaCHS1、HaCHS1A、HaCHS1B、HaCHS2、HaCDA1、HaCDA2、HaCDA5a和HaCDA5b）的HT115菌液喂食。RT-qPCR檢測(cè)喂食處理2 d的幼蟲發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲的靶標(biāo)基因表達(dá)量都出現(xiàn)了下調(diào)，但是下降的幅度不同（以對(duì)照為1