棉鈴蟲(chóng)神經(jīng)肽allatotropin G蛋白偶聯(lián)受體的克隆和鑒定.pdf

1、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）屬于鱗翅目夜蛾科（Lepidoptera Noctuidae），在世界各地廣泛分布，是我國(guó)和世界農(nóng)業(yè)的主要害蟲(chóng)之一。昆蟲(chóng)神經(jīng)肽促咽側(cè)體素(allatotropin，AT)主要調(diào)控保幼激素的合成，進(jìn)而調(diào)控昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育及生殖。昆蟲(chóng)神經(jīng)肽的受體主要為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，把胞外信號(hào)傳遞到胞內(nèi)，對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、免疫、代謝及行為等起重要的調(diào)控作用，GPCR一直是綠色農(nóng)藥研發(fā)最主

2、要的藥靶。因此，對(duì)棉鈴蟲(chóng)的allatotropin的GPCR進(jìn)行克隆和鑒定，為進(jìn)一步把這些新型配體開(kāi)發(fā)成控制棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的綠色農(nóng)藥建立基礎(chǔ)。
　　利用RACE方法，克隆獲得棉鈴蟲(chóng)allatotropin(Har-AT)受體基因(Har-ATR)全長(zhǎng)cDNA序列，棉鈴蟲(chóng)ATR的ORF為1341bp，編碼466個(gè)氨基酸，5'端非編碼區(qū)長(zhǎng)236bp，3'端非編碼區(qū)長(zhǎng)341bp。棉鈴蟲(chóng)ATR包含G蛋白偶聯(lián)受體典型的7次跨膜結(jié)構(gòu)域，與鱗翅

3、目其他昆蟲(chóng)的ATR相一致。系統(tǒng)發(fā)育分析表明棉鈴蟲(chóng)ATR與煙草天蛾ATR處于同一分支，且與煙草天蛾的氨基酸同源性為72.2％。
　　利用定量PCR技術(shù)，明確了棉鈴蟲(chóng)allatotropin及受體基因的組織分布和發(fā)育表達(dá)。Har-AT在胸腺中表達(dá)最高，其次是腦，在中腸與脂肪體中不表達(dá)。而Har-ATR在腦中表達(dá)量最高，在各組織均有表達(dá)。在腦組織中，Har-AT在蛹8天表達(dá)量最高，其次為蛹10天;Har-ATR在5齡幼蟲(chóng)第2天表達(dá)量最高

4、，其次為蛹10天，與Har-AT發(fā)育表達(dá)模式稍有差別。
　　構(gòu)建并獲得含Har-ATR的ORF的pcDNA5重組質(zhì)粒(pcDNA5FRT-HATR)，轉(zhuǎn)染到CHO-WT11細(xì)胞株，與棉鈴蟲(chóng)4種AT進(jìn)行結(jié)合活性分析。4種AT與HATR均引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的增加，呈現(xiàn)特異性的響應(yīng)關(guān)系。Har-AT、Har-ATL-Ⅰ、Har-ATL-Ⅱ、Har-ATL-Ⅲ的EC50值分別為6.9364×10-5 mM、2.8744×10-7mM、

5、1.3061×10-6mM和2.38×10-3 mM。上述結(jié)果證明我們克隆的Har-ATR是Har-AT的受體，Ca2+是Har-ATR的信號(hào)通路中的第2信使;與Har-ATR結(jié)合活性最高的為Har-ATL-Ⅰ的，其次是Har-AT和Har-ATL-Ⅱ，Har-ATL-Ⅲ最低?？紤]到細(xì)胞株對(duì)受體的鑒定影響較大，把pcDNA5FRT-HATR轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞株中，4種Har-AT與HATR均引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的增加，呈現(xiàn)特異性的

6、響應(yīng)關(guān)系;HEK293細(xì)胞株中結(jié)合的活性略低于CHOWT11細(xì)胞株，但是結(jié)合活性的順序與CHOWT11細(xì)胞株一致。
　　進(jìn)一步測(cè)驗(yàn)是否配體與Har-ATR的結(jié)合激活，是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的改變。把pcDNA5-Har-ATR或pcDNA5空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK細(xì)胞株中，結(jié)果顯示配體和Har-ATR結(jié)合后cAMP響應(yīng)不明顯，因此cAMP并非Har-AT激活Har-ATR的主要第2信使通路，Ca2+是Har-ATR的信號(hào)通路中主要

7、的第2信使。
　　前面的結(jié)果顯示Har-AT主要的配體是Har-ATL-Ⅰ、Har-AT和Har-ATL-Ⅱ，合成3個(gè)配體的C端的5個(gè)氨基酸模擬肽（命名為AT、ATL1和ATL2），利用CHOWT11細(xì)胞株檢測(cè)3個(gè)模擬肽與HATR的結(jié)合活性。ATL1和HAR-ATR結(jié)合后引起的Ca2+的響應(yīng)較弱，ATL1與Har-ATR結(jié)合的EC50值為2.16×10-3mM，與Har-ATLⅢ的結(jié)合活性相當(dāng)，AT和ATL2與Har-ATR的結(jié)合