棉鈴蟲受體蛋白在Cry1Ac、Cry2Ab交互抗性中的作用.pdf

1、自1996年開始，轉(zhuǎn)Bt基因棉花的投入使用，標志著一種新的依賴植物自身產(chǎn)生殺蟲蛋白的防治策略被應用到保護作物、防治害蟲上來。Bt作物的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益使其種植面積在過去的20年迅速增加，與此同時害蟲的抗性問題也日益嚴重。為了延緩害蟲對Bt的抗性，目前很多國家都開始種植轉(zhuǎn)雙個或多個Bt基因的棉花（pyramids策略）來取代第一代轉(zhuǎn)單價的Bt棉花。理想的“pyramids”策略認為害蟲對其中一個毒素產(chǎn)生了抗性會被另外的毒素殺死。目前，這

2、種策略指導下的轉(zhuǎn)Cry1Ac和Cry2Ab的棉花（Bollgard II）已經(jīng)在澳大利亞，印度和美國廣泛種植，但是目前中國還只是種植一代轉(zhuǎn)Cry1Ac的棉花。中國一代轉(zhuǎn)Bt棉花的大面積種植，田間害蟲的抗性水平也在顯著的增加。盡管二代雙價棉花比一代轉(zhuǎn)Bt棉花要耐受一些，然Cry1Ac和Cry2Ab的交互抗性也是制約該雙價棉花大面積應用的一個重要因素。我們的前期研究結果已經(jīng)表明棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）對Cry1Ac

3、和Cry2Ab存在一定程度的交互抗性。同時，Cry1A類毒素的作用機理和抗性機制復雜多變，Cry2Ab的作用機制和抗性機制鮮為人知，這些問題的日益激化和突出，迫切的需要我們研究Cry1Ac和Cry2Ab交互抗性的機制，這將為二代轉(zhuǎn)基因棉花的引入提供理論依據(jù)，為明確毒素的機理和昆蟲的抗性機制提供思路。
　　本文首先從基因組學和蛋白質(zhì)組學的角度分析抗感棉鈴蟲（H.armigera）中的抗性差異基因。其次，為了快速有效的研究這些抗性差異

4、基因是否參與Cry1Ac和Cry2Ab的作用機制中，本研究利用美洲棉鈴蟲（Helicoverpazea）中腸細胞系，脂肪體細胞系和Sf9細胞系，建立細胞毒理測定方法。通過Ligand blot和Western blot分析毒素與受體的結合、細胞內(nèi)真核表達目的基因、dsRNA細胞內(nèi)干擾和siRNA活體干擾目的基因的實驗方法分析比較了抗性差異基因在Cry1Ac和Cry2Ab作用機制中的作用，并對受體蛋白在Cry1Ac的作用機制中的互作進行了

5、分析，其主要結果如下：
　　1：通過基因水平分析LF敏感和LF抗性品系（LF5、LF10、LF20、LF30、LF60和LF120）之間的基因差異，以及蛋白水平分析LF、LF5、LF10、96S、96+2Ab、96-2Ab、96+1Ac和96-1Ac中可能調(diào)控棉鈴蟲對Cry1Ac和Cry2Ab的抗性差異蛋白，發(fā)現(xiàn)cadherin、APN1、ALP2、ABCC2、V-ATPase a、V-ATPase c和ATP synthase都

6、有可能參與棉鈴蟲對Cry1Ac和Cry2Ab的抗性。
　　2：建立細胞毒理實驗的方法體系：細胞培養(yǎng)基是毒理實驗的最佳緩沖液；4.5 h和5.5h分別是觀察Cry1Ac和Cry2Ab毒理的最佳時間。并發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲Cry1Ac和Cry2Ab的受體存在較大差異。
　　3：在細胞中表達受體或干擾受體，以及幼蟲活體干擾實驗表明：美洲棉鈴蟲的 Cadherin、APN1、ALP2、ABCC2和V-ATPa是Cry1Ac的功能受體、而Cad