小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的分子機(jī)制研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis,所產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal proteins,ICPs),對靶標(biāo)昆蟲具有高度選擇性,但對人等非靶標(biāo)生物及環(huán)境友好安全在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用,在害蟲防治中起著巨大的作用,和其它化學(xué)殺蟲劑一樣,長期處于Bt選擇壓力之下的害蟲亦會對其產(chǎn)生抗性。據(jù)報道已有多種昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性,但小菜蛾P(guān)lutella xylostella仍是至今唯一在田間

2、發(fā)現(xiàn)對Bt制劑產(chǎn)生抗性的害蟲。
　　 為明確小菜蛾對Bt產(chǎn)生抗性的機(jī)制,對田間小菜蛾的Bt抗性治理提供一定的理論基礎(chǔ),本文對小菜蛾進(jìn)行室內(nèi)抗藥性汰選、小菜蛾生物學(xué)特征觀察、適合度的研究以及對小菜蛾幼蟲體內(nèi)類鈣粘蛋白基因(Cadherin-like Protein,簡稱CAD)的克隆和表達(dá),具體結(jié)果如下:
　　 1.通過兩年的抗性汰選工作,抗性小菜蛾種群對CrylAc毒素的抗性水平從750倍提高到目前的1,500倍以上。觀

3、察了4℃處理蛹(7d)以及抗敏雜交對小菜蛾產(chǎn)卵量的影響,4℃處理蛹能夠顯著降低小菜蛾的產(chǎn)卵量,從雜交實驗可以看到抗性種群(CrylAcR)、反交種群(SS♂×CrylAcR♀)的產(chǎn)卵量顯著低于敏感種群(SS)和正交種群(SS♀×CrylAcR♂)的產(chǎn)卵量,推斷低溫對蛹的處理以及雜交雌蟲的抗性水半可能影響小菜蛾的產(chǎn)卵量。
　　 2.構(gòu)建小菜蛾種群生命表,比較了抗性和敏感小菜蛾種群一系列生物學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明,與敏感種群SS相比,抗性

4、種群CrylAcR蛹重顯著減輕,單雌產(chǎn)卵量顯著減少,雌雄比、孵化率以及化蛹率都顯著降低,同時CrylAcR種群的內(nèi)稟增長率、凈增長率和內(nèi)周限增長率均有所減小,抗性品系的相對適合度僅為敏感品系的0.57。小菜蛾抗性種群在生長發(fā)育和繁殖能力方面顯示了顯著的不利性。
　　 3.克隆了小菜蛾SS、CrylAcR兩種群的類鈣粘蛋白基因,該基因cDNA的全長為5148bp,編碼1716個氨基酸。對抗、敏兩種群的類鈣粘蛋白進(jìn)行比對,其堿基相似

5、性為98.3％、氨基酸相似性為98.8％,與敏感種群SS相比,抗性種群CrylAcR有87個堿基、21個氨基酸不同。通過同源性分析可知,該基因與其它昆蟲體內(nèi)的類鈣粘蛋白的同源性高。
　　 4.運(yùn)用Bac-to-Bac系統(tǒng)進(jìn)行CAD的表達(dá),將構(gòu)建的CAD重組桿狀病毒以沒有連接外源基因的表達(dá)載體作為對照轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,然后收集轉(zhuǎn)染CAD基因和空載體的細(xì)胞以及沒有轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞的蛋白。將收集的蛋白進(jìn)行SDS—PAGE電泳檢測,結(jié)果表明