棉鈴蟲SCD423品系對Bt蛋白Cry1Ac的抗性機(jī)理.pdf

1、2011年全球轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲作物面積超過6600萬公頃，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的45％,其中Bt棉花種植面積已經(jīng)達(dá)到1600萬公頃。Bt棉花的種植不僅控制了棉鈴蟲對棉花造成的危害，增加棉花產(chǎn)量，提高了農(nóng)民收入，還減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用量，帶來很好的環(huán)境效益。隨著Bt棉花種植時間的增加，棉鈴蟲對其產(chǎn)生抗性的風(fēng)險日益增加，棉鈴蟲Bt抗性問題是Bt棉花可持續(xù)應(yīng)用的重要限制因素之一。根據(jù)近年來的研究報告，已發(fā)現(xiàn)我國田間棉鈴蟲對Bt棉花的抗性等位基因頻

2、率在緩慢上升，多種類型的抗性等位基因也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，這些抗性基因大多與棉鈴蟲中腸Bt受體基因的突變相關(guān)。但是田間棉鈴蟲抗性基因未來演化方向如何？抗性處于何種階段？棉鈴蟲對Bt毒素的抗性除了鈣粘蛋白基因突變外還有哪些機(jī)理？這些問題都迫切需要開展進(jìn)一步的研究。
　　在2009年和2012年分別采用F2篩選法對河南安陽地區(qū)棉鈴蟲種群抗性等位基因頻率進(jìn)行了檢測，對棉鈴蟲田間種群對Cry1Ac抗性等位基因進(jìn)行了分離和鑒定，并對其中一種非隱性、

3、非鈣粘蛋白突變的C巧1Ac高抗品系的抗性機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究。研究結(jié)果表明，田間棉鈴蟲抗性等位基因頻率已達(dá)到5％,抗性基因具有多樣化的遺傳方式，非隱性抗性個體在抗性個體中占大多數(shù);棉鈴蟲中腸蛋白酶對Cry1Ac解毒作用增強(qiáng)可以導(dǎo)致對Cry1Ac毒素產(chǎn)生非隱性的高水平抗性。本文的研究結(jié)果對開發(fā)高效的棉鈴蟲Bt抗性監(jiān)測方法和適應(yīng)性的抗性治理策略提供了重要理論基礎(chǔ)。
　　1.田間棉鈴蟲抗性等位基因多樣性和非隱性抗性品系選育
　　河南

4、安陽地區(qū)自1997年開始種植表達(dá)Cry1Ac毒素的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。為了明確該地區(qū)棉鈴蟲對Bt棉花抗性演化的現(xiàn)狀，于2009、2012年采用了F2篩選法對河南安陽棉鈴蟲種群進(jìn)行抗性等位基因頻率監(jiān)測。累計對258個單雌系進(jìn)行了F2篩選，Cry1Ac抗性等位基因頻率在2009年為0.052(0.039-0.080)，在2012年為0.056(0.037-0.078)。該結(jié)果表明抗性等位基因頻率已達(dá)較高水平，但3年間變化不大。
　　對200

5、9年F2篩選的部分陽性單雌系進(jìn)一步篩選，獲得8個Cry1Ac抗性品系。遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果表明，在這8個田間抗性品系中，6個品系攜帶隱性遺傳的鈣粘蛋白抗性等位基因，1個品系攜帶非隱性遺傳的鈣粘蛋白抗性等位基因，1個品系(AY423)攜帶非隱性遺傳的非鈣粘蛋白抗性等位基因。該結(jié)果揭示了在同一個棉鈴蟲田間種群中存在多樣化的抗性機(jī)理和遺傳方式。根據(jù)F2篩選結(jié)果進(jìn)行估算，抗性個體中攜帶一個非隱性抗性基因的比例高達(dá)69.2％-92％，非隱性抗性基因在

6、棉鈴蟲對Bt抗性演化中具有重要作用。
　　與SCD敏感品系相比，AY423品系對Cry1Ac活化毒素抗性達(dá)660倍，對Cry1Aa和Cry1Ab毒素有交互抗性，但是對Cry2Ab毒素沒有交互抗性。為了更好研究AY423品系的抗性機(jī)理，將AY423與SCD進(jìn)行雜交、重復(fù)回交，并進(jìn)行Cry1Ac篩選，成功構(gòu)建了遺傳背景與SCD一致的近等基因系SCD423。
　　2.棉鈴蟲幼蟲中腸Bt受體基因的分析及BBMV與毒素的互作
　

7、　昆蟲中腸BBMV上受體與毒素結(jié)合在Cry1Ac毒素致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，毒素受體的改變會引起昆蟲對Cry1Ac毒素的抗性。本章探究了SCD423抗性品系中腸受體在Cry1Ac抗性形成中的作用。首先，克隆了10個Bt受體基因(HaCad,HaAPN1-6，HaALP1-2，HaABCC2)，遺傳分析表明這10個基因與Cry1Ac抗性不連鎖;其次，利用實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)比較了抗性品系SCD423與敏感品系SCD之間10個受體基因

8、mRNA的表達(dá)量，各受體表達(dá)量差異較小，并通過Western Blot分析發(fā)現(xiàn)抗性與敏感品系HaCad受體在蛋白水平上的表達(dá)量沒有差異;最后，利用ELISA法測定毒素與中腸BBMV飽和性結(jié)合，結(jié)果表明SCD423抗性品系和SCD敏感品系中腸BBMV與Cry1Ac的親和力常數(shù)值分別為39nM和25nM，差異不明顯。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，棉鈴蟲中腸BBMV毒素受體的變異在SCD423品系的抗性形成過程中不起主要作用。
　　3.棉鈴蟲幼

9、蟲中腸蛋白酶在SCD423抗性形成中的作用
　　昆蟲中腸蛋白酶對Bt毒素的活化和降解有重要的作用，中腸蛋白酶的改變可以導(dǎo)致昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性。首先通過比較SCD423抗性品系與SCD敏感品系中腸蛋白酶對模式底物活性，在離體條件下對毒素的降解作用，以及蛋白酶抑制劑對毒素的增效作用來探究中腸蛋白酶在抗性形成中的作用;再通過比較抗性和敏感品系蛋白酶基因序列和mRNA表達(dá)量的差異來明確與Cry1Ac抗性相關(guān)的蛋白酶基因。研究結(jié)果表明:

10、
　　(1)SCD423品系中腸蛋白酶對模式底物的活性略高于敏感品系，同時對原毒素的活化也快于敏感品系;
　　(2)SCD423品系中腸酶液能對Cry1Ac活化毒素N端進(jìn)一步切除，而SCD敏感品系則不能;
　　(3)在SCD423抗性品系中，蛋白酶抑制劑TLCK和TPCK對Cry1Ac具有顯著增效作用;
　　(4)胰蛋白酶基因HaSP6，HaSP7，HaSP9和HaSP24在SCD423抗性品系中的表達(dá)量分別是敏

11、感品系的2.0，3.1，5.0和4.6倍。
　　因此，中腸蛋白酶的過量表達(dá)導(dǎo)致對Cry1Ac毒素的解毒作用增強(qiáng)是SCD423品系對Cry1Ac產(chǎn)生抗性的重要機(jī)理。
　　上述研究結(jié)果表明，SCD423品系對Cry1Ac毒素的抗性形成與中腸BBMV上毒素受體無關(guān)，中腸蛋白酶基因的過量表達(dá)是SCD423品系對Cry1Ac毒素產(chǎn)生抗性的重要原因。中腸蛋白酶的改變可以介導(dǎo)棉鈴蟲對Cry1Ac毒素非隱性遺傳方式的高水平抗性形成，為未來靶