Bt Cry1Ac毒素在二點(diǎn)委夜蛾中腸受體蛋白APN基因克隆及功能分析.pdf

1、二點(diǎn)委夜蛾(Athetis lepigone)是近年來新發(fā)現(xiàn)的我國(guó)玉米苗期危害較為嚴(yán)重的害蟲之一，隨著玉米種植面積的不斷推廣，玉米收割后大量玉米茬的殘存，加之二點(diǎn)委夜蛾幼蟲隱蔽危害的習(xí)性，常規(guī)的化學(xué)農(nóng)藥發(fā)揮殺蟲作用效果不佳，因此開展利用病原微生物對(duì)二點(diǎn)委夜蛾進(jìn)行生物防治的研究，成為探索和控制其危害一條科學(xué)有效的途徑。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)生物制劑的研制為昆蟲的生物防治提供了新的策略。Bt

2、毒素蛋白與昆蟲中腸上的刷狀緣膜(Brush border membrane vesicles，BBMV)受體蛋白結(jié)合，使其中腸的細(xì)胞膜上形成孔洞，滲透壓失去平衡，導(dǎo)致昆蟲死亡。由此看出，Bt毒素蛋白和昆蟲中腸的受體蛋白的結(jié)合起著極其重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已表明Bt Cry1Ac毒素對(duì)二點(diǎn)委夜蛾幼蟲具有高毒力，并與昆蟲中腸受體氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)APN蛋白特異結(jié)合，本論文將進(jìn)一步開展受體蛋白APN基因

3、的克隆和功能鑒定的研究，為進(jìn)一步了解Bt毒素作用機(jī)理和二點(diǎn)委夜蛾的生物防治提供了理論支持。
　　本研究以二點(diǎn)委夜蛾為研究對(duì)象，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增中腸受體蛋白APN全長(zhǎng)基因，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)APN基因進(jìn)行序列分析，利用半定量PCR技術(shù)檢測(cè)APN基因在二點(diǎn)委夜蛾不同蟲態(tài)不同組織幼蟲不同齡期的表達(dá)量差異，利用RNAi干擾技術(shù)驗(yàn)證APN基因功能，主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用PCR擴(kuò)增和RACE擴(kuò)增獲得了二點(diǎn)委夜蛾幼蟲中腸A

4、PN1和APN5基因的全長(zhǎng)序列，這兩個(gè)基因序列全長(zhǎng)分別為3378bp和3140bp，開放閱讀框分別為3309bp和2979bp，分別編碼1103和993個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)分別為4.79和4.82，分子量均為120kDa。推導(dǎo)的APN1氨基酸序列中，N末端含有33個(gè)氨基酸組成的疏水性信號(hào)肽序列，裂解位點(diǎn)位于33和34位之間(QAV-VS)，含有33個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，具有GAMEN保守區(qū)，1個(gè)典型的GPI中腸受體

5、蛋白結(jié)合位點(diǎn)。推導(dǎo)的APN5氨基酸序列中（Genebank登錄號(hào):KU950745），N末端含有17個(gè)氨基酸組成的疏水性的信號(hào)肽，裂解位點(diǎn)位于17和18位之間(IVA-DS)，含有31個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，具有GATEN保守區(qū)，2個(gè)典型的GPI中腸受體蛋白結(jié)合位點(diǎn)。二點(diǎn)委夜蛾APN1和APN5基因的同源性較低，為29.3％，與已報(bào)道的其他昆蟲APN氨基酸序列比對(duì)，二點(diǎn)委夜蛾的APN1基因和棉鈴蟲(Helicoverpa

6、armigera)APN1(GenBank登錄號(hào)AAK85538)基因同源性最高為52.86％。二點(diǎn)委夜蛾的APN5基因和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)APN5（GenBank登錄號(hào)KF900124）基因的同源性最高為68％。
　　2、利用半定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)APN1和APN5基因在二點(diǎn)委夜蛾幼蟲的不同組織、不同蟲態(tài)和幼蟲不同齡期的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)APN1和APN5基因在二點(diǎn)委夜蛾各個(gè)發(fā)育階段均可以表達(dá)，APN1在四

7、齡和五齡幼蟲期表達(dá)量略高于前三個(gè)齡期，APN5在三齡幼蟲期表達(dá)量最高而在初孵幼蟲期表達(dá)量最低，APN1和APN5基因在二點(diǎn)委夜蛾四個(gè)不同蟲態(tài)和幼蟲不同組織的表達(dá)量沒有明顯差異。
　　3、利用siRNA方法檢測(cè)APN5基因的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二點(diǎn)委夜蛾取食含siRNA的飼料后，對(duì)Cry1Ac毒素蛋白具有較弱的抗性，死亡率為32％。二點(diǎn)委夜蛾幼蟲注射siRNA后對(duì)Cry1Ac毒素蛋白具有較強(qiáng)的抗性，死亡率為6.9％;Cry1Ac毒素對(duì)