棉鈴蟲江浦和安陽種群對CrylAc和Cry2Ab抗性基因頻率及抗性遺傳方式.pdf

1、表達(dá)蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白的轉(zhuǎn)基因Bt作物在全球范圍推廣種植，有效控制了重要作物上靶標(biāo)害蟲的為害，同時(shí)減少了化學(xué)殺蟲劑的使用。Bt棉花自1997年開始在我國種植，目前Bt棉花種植面積已經(jīng)占我國棉花總種植面積70％左右，Bt棉花的大范圍推廣，有效地抑制了棉花及其他寄主作物上棉鈴蟲的種群密度。鑒于在其他國家已經(jīng)有田間害蟲對Bt作物產(chǎn)生抗性進(jìn)化的先例及在我國北方棉區(qū)部分田間種群對Cry1Ac敏感性下降的報(bào)道，棉鈴蟲對Bt棉花的抗性進(jìn)化一直是B

2、t棉花持續(xù)應(yīng)用的最大威脅。
　　 目前，主要依據(jù)對害蟲室內(nèi)Bt抗性品系的研究結(jié)果來制定相應(yīng)的抗性檢測方法和治理措施，高劑量/庇護(hù)所和基因疊加是現(xiàn)行的兩種主要抗性治理策略。靶標(biāo)害蟲自然種群Bt抗性的進(jìn)化過程比室內(nèi)篩選品系復(fù)雜，因此，基于對田間種群抗性基因的檢測鑒定及其抗性遺傳方式的研究對建立更加合理的抗性監(jiān)測和治理策略具有重要意義。為此，通過F1檢測技術(shù)對來自長江流域和黃河流域的兩個(gè)棉鈴蟲田間種群進(jìn)行了抗性基因檢測，鑒定到大量與室

3、內(nèi)抗性品系不同的抗性基因，發(fā)現(xiàn)了田間種群鈣粘蛋白抗性等位基因的多樣性。通過建立不同的田間抗性等位基因純合品系進(jìn)行抗性遺傳互補(bǔ)研究，發(fā)現(xiàn)田間種群至少存在2種不同的抗性機(jī)制。Cry2Ab是基因疊加轉(zhuǎn)基因棉花的一種重要候選基因，通過對河南安陽棉鈴蟲田間種群室內(nèi)篩選獲得了Cry2Ab抗性品系，并對其抗性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評估。本文的研究結(jié)果對于我國棉鈴蟲對Bt棉花抗性的監(jiān)測和治理具有重要指導(dǎo)意義。
　　 1.棉鈴蟲江蘇江浦種群鈣粘蛋白基因突變的

4、多樣性
　　 通過F1檢測對2008年江蘇江浦棉鈴蟲田間種群進(jìn)行了與Cry1Ac抗性相關(guān)的鈣粘蛋白突變基因頻率估算及鑒定。在本試驗(yàn)中，成功檢測了123個(gè)采集自江蘇江浦的田間棉鈴蟲與室內(nèi)抗性品系SCD-r1（r1純合子）雜交單對系的F1后代。在六個(gè)候選單對系中，共鑒定到5種不同的鈣粘蛋白（Ha_BtR）突變等位基因（r4-r8）。在5個(gè)抗性基因中，由于在基因組DNA中發(fā)生堿基替換或插入突變而導(dǎo)致基因發(fā)生突變。在另外兩個(gè)候選單對系中

5、，檢測到完整的鈣粘蛋白等位基因，推測在兩個(gè)單對系的田間親本個(gè)體上，可能攜帶由于氨基酸點(diǎn)突變而導(dǎo)致鈣粘蛋白受體功能喪失的抗性基因，或者攜帶其它位點(diǎn)的抗性基因。通過計(jì)算，2008年江蘇江浦種群鈣粘蛋白突變基因頻率為0.024(0.010-0.055)。結(jié)合之前在棉鈴蟲中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3個(gè)鈣粘蛋白突變等位基因（r1、r2和r3）與Cry1Ac抗性相關(guān)，目前已經(jīng)在我國3個(gè)棉鈴蟲田間種群中發(fā)現(xiàn)8個(gè)不同的鈣粘蛋白突變基因，田間突變基因的多樣性將嚴(yán)重影響D

6、NA分子檢測技術(shù)的有效性，F(xiàn)1檢測技術(shù)用于棉鈴蟲田間種群的抗性基因檢測將更加切實(shí)有效。
　　 2.棉鈴蟲河南安陽種群抗性基因頻率檢測及鈣粘蛋白基因突變鑒定
　　 通過F1檢測對2009年河南安陽棉鈴蟲田間種群進(jìn)行了與Cry1Ac抗性相關(guān)基因的頻率估算及鑒定。在成功檢測到的215個(gè)單對系中，發(fā)現(xiàn)34個(gè)候選單對的田間個(gè)體可能攜帶抗性基因，該地區(qū)田間棉鈴蟲種群對Cry1Ac的抗性基因頻率為0.091(0.066-0.123)。

7、在候選的陽性單對中，鑒定到胞內(nèi)區(qū)缺失突變與可變剪接兩種新型的鈣粘蛋白突變基因，進(jìn)一步豐富了田間鈣粘蛋白基因突變的多樣性。同時(shí)檢測到大量正常翻譯的鈣粘蛋白等位基因，這些基因可能存在氨基酸替換引起的抗性突變。
　　 通過檢測陽性單對系F1存活幼蟲與室內(nèi)敏感品系雜交后代，進(jìn)行田間抗性基因顯隱性鑒定，發(fā)現(xiàn)86％的田間個(gè)體攜帶隱性抗性基因，其余14％的個(gè)體攜帶非隱性抗性基因。盡管在田間種群中檢測到大量個(gè)體攜帶隱性抗性基因，但通過間接和直接

8、法預(yù)測田間存活個(gè)體的基因型，發(fā)現(xiàn)至少攜帶一個(gè)非隱性抗性基因的個(gè)體分別占80％和49％。在田間種群的抗性進(jìn)化中，非隱性抗性基因在決定田間抗性個(gè)體頻率中的貢獻(xiàn)高于隱性抗性基因，因此研究和開發(fā)針對非隱性抗性基因的監(jiān)測技術(shù)和抗性治理策略將更加重要和迫切。
　　 3.F1篩選獲取的棉鈴蟲Cry1Ac抗性等位基因的遺傳方式及遺傳互補(bǔ)
　　 建立了5個(gè)不同的田間抗性等位基因純合品系Jp14，An1，An29，An357，An156并進(jìn)

9、行了抗性分析。生物測定顯示，與敏感品系SCD相比，5個(gè)抗性品系對Cry1Ac活化毒素分別具有128，215，41，881，121倍的抗性，對Cry2Ab毒素?zé)o交互抗性。通過與敏感品系的正反交和回交分析表明，Jp14為不完全隱性抗性，An1，An29，An357，An156為不完全顯性抗性，5個(gè)品系均為常染色體，單基因遺傳。通過與室內(nèi)抗性品系SCD-r1雜交進(jìn)行遺傳互補(bǔ)分析發(fā)現(xiàn)，Jp14，An1，An29，An357品系中的抗性基因和SC

10、D-r1品系的抗性基因均存在遺傳互補(bǔ)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了F1檢測技術(shù)的有效性。An156品系可能為其它位點(diǎn)導(dǎo)致的不完全顯性抗性。本研究表明:(1)F1篩選可以同時(shí)檢測到隱性抗性等位基因和非隱性抗性等位基因;(2)棉鈴蟲鈣粘蛋白抗性基因突變的多樣性可以導(dǎo)致抗性水平和抗性遺傳方式的多樣性;(3)在選用抗性監(jiān)測方法和設(shè)計(jì)抗性治理策略時(shí)，應(yīng)充分考慮到棉鈴蟲田間種群中存在的非隱性抗性等位基因。
　　 4.棉鈴蟲Cry2Ab抗性品系的交互抗性

11、及抗性遺傳方式
　　 通過對2009年采自河南安陽的棉鈴蟲田間種群在室內(nèi)用Cry2Ab4毒素進(jìn)行連續(xù)篩選，獲得了對Cry2Ab4具有高水平抗性的An2Ab品系。An2Ab抗性品系在篩選至第11代時(shí)與起始種群An相比，對Cry2Ab4具有262倍的抗性，同時(shí)對Cry1Ac活化毒素具有37倍的交互抗性?？剐赃z傳研究發(fā)現(xiàn)，在第11代時(shí)，An2Ab品系對Cry2Ab和Cry1Ac毒素同為不完全顯性、常染色體遺傳，對兩種毒素的抗性都為多基