棉鈴蟲漆酶Ⅱ基因的分子鑒定及功能分析.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera是棉花、玉米、煙草、番茄等作物上的重要害蟲。廣泛分布于世界各地，在中國(guó)的棉花產(chǎn)區(qū)和蔬菜種植區(qū)均大量發(fā)生，對(duì)經(jīng)濟(jì)作物造成重大影響。棉鈴蟲屬于全變態(tài)昆蟲，發(fā)生量大，易人工飼養(yǎng)，現(xiàn)已成為鱗翅目昆蟲研究的模式昆蟲，且已進(jìn)行了許多基礎(chǔ)方面的研究。漆酶Ⅱ(laccase2，LAC2)是酚氧化酶的一種，是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和變態(tài)方面重要的調(diào)節(jié)酶。全變態(tài)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，需要經(jīng)過(guò)周期性的蛻皮，才能完成其變態(tài)發(fā)育過(guò)程

2、。但是昆蟲蛻皮后，新生表皮較柔軟，抵抗力差，必須完成黑化和硬化過(guò)程，才能使蟲體得到保護(hù)。LAC2主要通過(guò)“醌鞣化”作用促進(jìn)昆蟲表皮黑化和硬化。本試驗(yàn)以棉鈴蟲為研究對(duì)象，采用PCR、RACE等技術(shù)，成功克隆得到lac2基因的全序列;并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究了lac2基因在棉鈴蟲不同蟲態(tài)和不同發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá);同時(shí)通過(guò)激素處理試驗(yàn)，明確了蛻皮激素和保幼激素類似物對(duì)lac2基因的調(diào)控作用;并通過(guò)RNA干擾蛻皮激素受體(ecdyso

3、ne receptor，EcR; ultraspiracle，USP)試驗(yàn)，明確了蛻皮激素對(duì)lac2基因表達(dá)的調(diào)控作用;通過(guò)RNA干擾技術(shù)，探明lac2基因在表皮黑化中的作用;最終在原核大腸桿菌細(xì)胞中大量表達(dá)了棉鈴蟲LAC2蛋白;主要結(jié)果如下:
　　(1)所得到的棉鈴蟲lac2基因cDNA序列全長(zhǎng)為3221bp，命名為AF790460(GenBank登錄號(hào):KF479388)，其開放閱讀框長(zhǎng)度為2268bp，編碼756個(gè)氨基酸殘基

4、。預(yù)測(cè)信號(hào)肽位于1～14位氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量大小為83.39 KD，等電點(diǎn)為6.94，平均疏水性蛋白為0.917。Blast搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲LAC2與其他昆蟲LAC2氨基酸序列具有較高的一致性，其中與家蠶Bombyx mori LAC2的一致性達(dá)95％，與煙草天蛾Manduca sexta LAC2的一致性達(dá)93％。通過(guò)SMART在線軟件我們發(fā)現(xiàn)LAC2序列中含有3個(gè)Cu-oxidase結(jié)構(gòu)域，其中第1個(gè)為Cu-oxidase-3，

5、分布于200～310位氨基酸，長(zhǎng)度為110;第2個(gè)為Cu-oxidase，分布于325～473位氨基酸，長(zhǎng)度為148;第3個(gè)為Cu-oxidase-2，分布于577～737位氨基酸，長(zhǎng)度為160個(gè)氨基酸。
　　(2)對(duì)棉鈴蟲lac2基因的時(shí)窄表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果顯示lac2基因在棉鈴蟲的不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但不同蟲態(tài)間表達(dá)量有差異。一般隨著棉鈴蟲幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，lac2基因表達(dá)量逐漸增高，在每齡幼蟲蛻皮期則高豐度表達(dá)，化蛹前

6、達(dá)到最高，在蛹期表達(dá)量則相對(duì)較低。在幼蟲的不同組織中l(wèi)ac2表達(dá)量有顯著差異，表皮中的表達(dá)量最高，為其它部位的10倍左右，中腸和血細(xì)胞中表達(dá)量較低。成蟲期蟲體不同組織中l(wèi)ac2表達(dá)量也有明顯差異，表皮、肌肉和脂肪體中的表達(dá)量相對(duì)較低，而在卵巢和觸角中的表達(dá)量則相對(duì)較高
　　(3)利用保幼激素類似物-Methoprene和蛻皮激素對(duì)5齡后48 h幼蟲進(jìn)行體外注射處理，處理后在不同時(shí)間取樣，通過(guò)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Methopre

7、ne可抑制lac2基因的表達(dá)。而以蛻皮激素處理后，結(jié)果顯示蛻皮激素可促進(jìn)lac2基因的表達(dá)。
　　(4)利用體外合成蛻皮激素受體EcR(ecdysone receptor)和USP(ultraspiracle)雙鏈RNA，注射入5齡后24 h幼蟲體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛻皮激素受體受到干擾后，ecr和usp基因的表達(dá)量顯著下降。對(duì)蛻皮激素受體受到干擾的和未受到干擾的處理，分別注射蛻皮激素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛻皮激素受體受到干擾后，lac2基因的表達(dá)量

8、明顯受到抑制，與未受到干擾的處理差異明顯。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了，蛻皮激素對(duì)lac2基因具有促進(jìn)其表達(dá)的調(diào)控作用。
　　(5)選取5齡期生長(zhǎng)良好，體色一致的初蛻皮棉鈴蟲幼蟲，注射體外合成的lac2基因雙鏈RNA，以GFP雙鏈RNA處理作為對(duì)照。24 h后利用超景深三維成像系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)，注射lac2基因雙鏈RNA的與GFP雙鏈RNA對(duì)照組相比，幼蟲體色黑化作用明顯減弱。
　　(6)實(shí)驗(yàn)室條件下成功構(gòu)建了棉鈴蟲lac2基因部分片段