棉鈴蟲(chóng)糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因的克隆及特征分析.pdf

1、鞘糖脂（GSLs）在諸如細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞分化和細(xì)胞發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用，同時(shí)它還是很多細(xì)菌毒素的受體，例如霍亂弧菌、痢疾桿菌。糖基轉(zhuǎn)移酶是GSLs合成的催化酶，相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（bre）的變異已經(jīng)在線蟲(chóng)中被證實(shí)與Bt抗性有關(guān)。在昆蟲(chóng)中，糖基轉(zhuǎn)移酶具有很大的類群，相關(guān)功能及變異的發(fā)生具有很大的不確定性，它不僅是鞘糖脂合成的催化酶，同時(shí)可能在鈣粘蛋白（CAD）、氨肽酶N（APN）、堿性磷酸酯酶（ALP）和糖蛋白的修飾過(guò)程中發(fā)揮作用，所以

2、糖基化變異可能不僅僅針只對(duì)一種 Bt毒素受體，可能會(huì)同時(shí)影響幾種重要的結(jié)合受體。本研究綜合運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)，首次克隆獲得Harmbre2-4 ORF全長(zhǎng)序列并初步研究了棉鈴蟲(chóng)糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-5的功能，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1、利用RT-PCR及RACE技術(shù)克隆獲得了棉鈴蟲(chóng)糖基轉(zhuǎn)移酶基因Harmbre2-4的ORF全長(zhǎng)序列并提交 GenBank。預(yù)測(cè) Harmbre2(GenBank KR3

3、62875)、Harmbre3(GenBank KR362876)和Harmbre4(GenBank KR362877)的ORF全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度分別為1011bp、1377bp和1275bp；分別編碼336、458和424個(gè)氨基酸；分子量分別為38、52和48kDa；等電點(diǎn)分別為8.75、8.62和8.90。氨基酸序列分析顯示 HarmBre2-4中只有 HarmBre4有信號(hào)肽序列。HarmBre2沒(méi)有跨膜區(qū)，而HarmBre3和Harm

4、Bre4分別有5個(gè)和1個(gè)跨膜區(qū)；每個(gè)氨基酸序列中都包含對(duì)該類糖基轉(zhuǎn)移酶的催化起重要作用的保守序列。HarmBre3和家蠶（Bombyx mori）的 Bre3（GenBank NP_001243979.1）的相似度高達(dá)86％，和小菜蛾（ Plutella xylostella）的 Bre3（ GenBank ADB79796.1）的相似度達(dá)到83%。HarmBre2和HarmBre4也和鱗翅目其他害蟲(chóng)的該類基因氨基酸序列具有很高的相似度

5、。
　　2、運(yùn)用 qPCR分析了 Harmbre2-5在棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)譜。結(jié)果顯示在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育階段中，Harmbre2、Harmbre3和Harmbre5在卵中表達(dá)量較高，Harmbre3和Harmbre4在成蟲(chóng)階段表達(dá)量也較高，Harmbre2-5在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)階段和蛹期的表達(dá)量相對(duì)較低，而且在不同的幼蟲(chóng)階段和蛹期的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。通過(guò)分析Harmbre2-5在棉鈴蟲(chóng)4齡幼蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)水平差異顯示：這四個(gè)基因

6、在棉鈴蟲(chóng)腸中的表達(dá)量都較低，尤其是在中腸中。Harmbre2在馬氏管中表達(dá)量較高；而在其他組織中表達(dá)量都比較低，且它們之間沒(méi)有顯著性差異。Harmbre3在頭部和圍食膜中表達(dá)量較高；Harmbre4在馬氏管中表達(dá)量較高；Harmbre5也相類似，在圍食膜和馬氏管中表達(dá)量較高。
　　3、通過(guò)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)對(duì) Harmbre2、3和5的功能進(jìn)行研究。結(jié)果顯示 Harmbre2、Harmbre3和 Harmbre5表達(dá)的蛋白均定位在高爾基

7、體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞器內(nèi)，而在細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有分布。
　　4、通過(guò)RNAi技術(shù)干擾Harmbre2-5基因的表達(dá)，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)沉默效率。結(jié)果顯示注射靶標(biāo)基因的 siRNA后，Harmbre2的基因表達(dá)水平下降30%左右，Harmbre3-5的基因表達(dá)水平下降50%左右。
　　5、通過(guò)RT-PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析Harmbre2-5在棉鈴蟲(chóng)抗感品系間的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)水平差異。結(jié)果顯示 Harmbre

8、3-5在棉鈴蟲(chóng) LF系列抗感品系間的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平?jīng)]有差異，Harmbre2在棉鈴蟲(chóng) LF系列低抗品系里的表達(dá)量顯著高于敏感品系，而且其基因結(jié)構(gòu)的5′UTR區(qū)，抗性品系與敏感品系相比缺失幾個(gè)堿基，5′UTR區(qū)有轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)的功能，推測(cè)這種差異可能與棉鈴蟲(chóng)Bt抗性有關(guān)。
　　以上結(jié)果表明，棉鈴蟲(chóng)bre基因在卵和成蟲(chóng)階段高表達(dá)，在幼蟲(chóng)階段和蛹期表達(dá)量較低，這表明 Harmbre可能與棉鈴蟲(chóng)的生育力和進(jìn)化有關(guān)；同時(shí)在馬氏管、圍食

9、膜和頭部表達(dá)量較高，而在腸中尤其是中腸中表達(dá)量很低，表明 Harmbre可能在棉鈴蟲(chóng)的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能方面發(fā)揮重要作用。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)表明糖基轉(zhuǎn)移酶主要分布在核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞質(zhì)部位。抗感品系差異分析發(fā)現(xiàn)Harmbre2在低抗棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)量較高，且在抗性品系中，其基因的5′UTR區(qū)也存在幾個(gè)堿基的變異，推測(cè) Harmbre2的表達(dá)上調(diào)或者基因突變可能引起棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的低水平抗性。本研究對(duì)棉鈴蟲(chóng)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的功能做