UDPG-甜菊糖苷葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶cCNA的克隆和序列分析.pdf

1、廈門大學(xué)碩士學(xué)位論文UDPG:甜菊糖苷葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶cCNA的克隆和序列分析姓名：田瑞陽申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳睦傳1999.5.1M o l e c u l a rC l o n i n ga n dS e q u e n c eA n a l a s i so fac D N Af o rⅥ) P G ：s t e v i o l —g l u c o s eG l u c o s y l t r a n s

2、f e r a s eA b s t r a c tS f 日v i ar e b a u d i a n aB e r t o n i ，t h e s w e e t h e r b o f S o u t hA m e r i c a ．w h i c ha c c u m u l a t e s s e v e r a l k i n d s o f h i g h l y —s w e e t ，l o w —c a l o

3、r i e ，n o n t o x i c a n ds t a b l e —c h e m i c a l —p r o p e r t y s t e v i o l —g l u c o s i d e s ，a r e p a i d m o r e a n d m o r ea t t e n t i o nt h e s ey e a r s ，a n di t i S v e r y1 i k e l yt ob e

4、c o m eam a j o rs o u r c eo fh i g h —p o t e n c ys w e e t e n e rf o rt h eg r o w i n gn a t u r ef o o dm a r k e ti n t h ef u t u r e ．F o rt h ed i r e c tr e l a t i o nb e t w e e nt h ep r o d u c eo fs t e

5、v i o l —g l u c o s i d e sa n dt h e e x p r e s s i o n o f U D P G ： s t e v i o l —g l u c o s i d e g l u c o s y l t r a n s f e r a s e s ，i n c r e a s et h ee x p r e s s i o no fU D P G ：s t e v i o l —g l u c

6、 o s i d eg l u c o s y l t r a n s f e r a s e sw i l lb eh e l p f u l t o i m p r o v et h ea c c u m u l a t i o no fs t e v i o l —g l u c o s i d e si nt h e 1 e a v e so fS t e v i ar e b a u d i a n aB e r t o n

7、i ．I n o r d e r t o c l o n e t h e c D N A o f U D P G ： S t e v i o l —g l u c o s i d e9 1 u c o s y l t r a n s f e r a s e s ，A n o n —e x p r e s s i v e c D N A l i b r a r y o f t h e l e a v e s o fS t e v i ar

8、 e b a u d i a n aB e r t o n i i s c o n s t r u c t e di n t h i s e x p e r i m e n t b yu s i n g 九p h a g eg t l 0a s v e c t o r ．T h ep r i m e r sg t la n dg t 2a r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h e c h a

9、 r a c t e r i s t i c c o n s e r v e d s e q u e n c e o f U D P G ：g l u c o s y l t r a n s f e r a s e s ．w h i c h r e s u l ti nt h eg l u c o s y l a t i o n o f s e c o n d a r y m e t a b o l i t e si nm a n yp

10、 l a n t s ．T h eD N Ao ft h er e c o m b i n e d 九g t i 0w h i c hi Se x t r a c t e df r o mt h ec D N Ai i b r a r yr e f e r r e da b o v ei Se m p l o y e d a st e m p l a t e a n dt h er e v e r s e dg e n e r a lp

11、 r i m e r n e a rt h em u l t i p l ec l o n i n gS i t eo n 九g t l 0i Su s e dt oc o n j u g a t er e s p e c t i v e l yw i t hg t l a n dg t 2 ．T h e n ，a5 1 7b pa n da3 7 7 b pf r a g m e n tw i l lb ea m p l i f i

12、e da f t e rp o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( P C R ) f o r t w o t i m e s ．T h e B A K f r a g m e n t i S c u t o f f f r o m t h e p B A K p l a s m i dw h i c h h a db e e ni n c e r t e db a k g e n eb

13、 e f o r e ．T h e nt h ee m p t yp C R I I p l a s m i di sr e c y c l i z e da n dt h e r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e E c o R V i S u s e d t o m a k e b l u n t e n d s ．A f t e ra d d i n gT i n t o t h

14、 e37 e n d s 。aT - v e c t o r i S o nU S e ．G T Ia n dG T 2a r ei n s e r t e di n t op C R I I a n ds e q u e n c e d ．S e q u e n c ea n a l y s i sp r o v e s t h a t b o t h o ft h e t w o f r a g m e n t s h a v e

15、t e r m i n a t i o n c o d o n ．t a i l i n gs i g n a l ．a(chǎn) n d p o i y At a i l ．T h es e a r c h i n g r e s u l to nB L A S T s e r v e rs u g g e s t st h a tG T 2 i S h o m o l o g o u s t o t h ep h o s p h o r i

16、b o s y l p y r o p h o s p h a t es y n t h a s e i n m a n ys p e c i e s ．B e s i d e st e r m i n a t i o nc o d o n ，t a i l i n ss i g n a l ，a n dp o l y At a i l ，6 T 1h a s t h e c h a r a c t e r i s t i c c o

17、n s e r v e d s e q u e n c e f r o mw h i c h t h e p r i m e r s a r ed e s i g n e d ．F u r t h e r m o r e ，t h e p r e d i c t e d a m i n o a c i d o fG T l a n d t h e U D P G ：g l u c o s y l t r a n s f e r a s

18、e s o f t h e s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s i n m a n y p l a n t s a r eh o m o l o g o u s ．W ec o n j e c t u r et h a tG T lm a yb e a f r a g m e n to fo n eo ft h eg e n e so fU D P G ：S t e v i o l —g l