普通小麥品種望水白中DON誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及功能分析.pdf

1、小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是一種由鐮刀菌（Fusarium graminearum）引起的，嚴(yán)重危害小禾谷類和玉米等作物的真菌性病害。赤霉病不僅會(huì)造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)，降低種子品質(zhì)，而且赤霉病菌還會(huì)在籽粒中聚積一些單端孢霉烯族（trichothecenes）毒素，嚴(yán)重危害人畜健康，其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）是最重要的一種毒素，不僅危害人畜健康，而且還被認(rèn)為是促進(jìn)赤霉

2、病發(fā)病的毒性因子。培育抗赤霉病特別是抗DON積累的小麥品種是減輕赤霉病危害的有效途徑。目前，在赤霉病五種抗性類型中對(duì)TypeⅠ（抗侵染）和TypeⅡ（抗擴(kuò)展）的研究較多且深入。隨著近年來愈來愈重視食品安全問題，毒素積累抗性類型(TypeⅢ)已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，但相關(guān)研究報(bào)道仍然較少，因此迫切需要克隆小麥毒素抗性相關(guān)基因并系統(tǒng)深入地研究毒素抗性機(jī)制。
　　 本研究利用Affymetrix小麥基因芯片對(duì)經(jīng)DON誘導(dǎo)后抗赤霉病小麥品種望

3、水白穗組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)受DON誘導(dǎo)后差異表達(dá)的基因。初步分析表明，具有推斷功能的表達(dá)顯著上調(diào)基因中，許多基因與抗?。ň┫嚓P(guān)，如：谷胱甘酞轉(zhuǎn)移酶、苯丙氨酸解氨酶、細(xì)胞色素P450酶以及抗病蛋白等，尤其還發(fā)現(xiàn)了一類與已報(bào)道的擬南芥中降解DON的DOGT1基因同一家族的尿核苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyltransferase, UGTs）基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證芯片雜交結(jié)果的可靠性并研究這些基因受DON誘導(dǎo)

4、后的表達(dá)模式，本研究在這些可能的抗?。ň┯嘘P(guān)基因中，選取了部分基因進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都受DON誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表達(dá)情況與芯片結(jié)果一致，推測(cè)這些基因可能與望水白抗DON有關(guān)。本研究還進(jìn)一步證明基因芯片是大規(guī)模分析小麥對(duì)DON反應(yīng)的基因表達(dá)譜高效而準(zhǔn)確的手段。芯片雜交結(jié)果為進(jìn)一步研究小麥對(duì)赤霉?。ɑ駾ON）的抗性以及抗赤霉病（或DON）相關(guān)基因的篩選與克隆提供了有價(jià)值的信息。
　　 芯片雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)表達(dá)

5、基因中基因編號(hào)為CA695961的一個(gè)EST上調(diào)表達(dá)25.5倍，該EST序列與已報(bào)道的與抗DON有關(guān)的UGTs家族基因同源，本研究根據(jù)該EST堿基序列設(shè)計(jì)基因特異引物，篩選本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的DON誘導(dǎo)望水白穗組織cDNA文庫，從中篩選到一個(gè)全長(zhǎng)的小麥UGT基因TaUGT3(GenBank accession FJ236328)。該基因的cDNA全長(zhǎng)1，755bp，包含編碼一個(gè)496氨基酸的UGT基因的ORF框。TaUGT3與已報(bào)道的來自于擬

6、南芥中能降解DON的DOGT1基因在氨基酸水平上有較高的同源性(43％)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示TaUGT3基因受DON的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，并且在抗赤霉病小麥品種望水白不同組織的表達(dá)情況有所差別，根與葉部的表達(dá)高峰相對(duì)穗部推遲了12h。雖然TaUGT3在抗、感赤霉病小麥品種穗中的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，但其在抗病品種望水白中最高峰時(shí)的表達(dá)強(qiáng)度明顯超過感病品種綿陽85-45。利用中國(guó)春缺體-四體和缺失系系列，將TaUGT3基因的3個(gè)直向同源基因

7、分別定位于普通小麥第三部分同源群染色體的短臂上。洋蔥表皮亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，TaUGT3基因主要位于細(xì)胞膜上和細(xì)胞核中。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TaUGT3基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。Northern雜交顯示，轉(zhuǎn)基因植株中TaUGT3基因可以超表達(dá)，且不同植株中表達(dá)水平有較大差異。DON抗性鑒定表明陽性轉(zhuǎn)基因植株中TaUGT3基因過量表達(dá)在一定程度上可以提高擬南芥對(duì)DON的耐受力，推測(cè)TaUGT3基因可能在小麥抗DON反應(yīng)中發(fā)揮作用。