杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3a的基因克隆與功能分析.pdf

1、N-連接糖基化是真核生物細(xì)胞中最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)修飾，這個(gè)過(guò)程是由位于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OST)催化的。Stt3p為OST的催化亞基，它在已知的OST亞基中是最保守的。研究發(fā)現(xiàn)酵母的Stt3p編碼一個(gè)78 kDa的蛋白，并且?guī)缀跛械恼婧松锘蚪M中都存在編碼酵母Stt3p蛋白的同系物。哺乳動(dòng)物的基因組編碼酵母Stt3p的兩種同系物STT3a和STT3b，它們的表達(dá)具有組織特異性差異，并能調(diào)節(jié)OST的活性，且含有一個(gè)STT3a亞

2、基的OST比含有STT3b亞基的OST對(duì)于選擇完全裝配的長(zhǎng)鏈寡糖供體(Glac3Man9Glc NAc2-PP-Dol)更具有特異性。最近的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥OST的STT3a亞基作為一種跨膜蛋白在高鹽應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。
　　 杜氏鹽藻(Dunaliella salina，D.salina)是一種高度耐鹽的單細(xì)胞雙鞭毛真核綠藻，它沒(méi)有細(xì)胞壁，能夠在0.5～5 mol/L NaCl鹽濃度下生存，具有很強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力。近年來(lái)，雖

3、然人們圍繞鹽藻的耐鹽機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但是目前對(duì)其耐鹽機(jī)制還不是十分清楚。另外，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)：在高鹽條件下，鹽藻的運(yùn)動(dòng)性明顯降低，而作為鹽藻運(yùn)動(dòng)器官的鞭毛直接參與了鹽藻的運(yùn)動(dòng)。
　　 為了解跨膜蛋白STT3a在鹽誘導(dǎo)反應(yīng)中的作用及鹽藻的鹽耐受性和鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性之間是否有潛在的聯(lián)系，本研究根據(jù)衣藻、擬南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR及RACE的方法擴(kuò)增

4、獲得杜氏鹽藻STT3a基因全長(zhǎng)的cDNA序列。然后將杜氏鹽藻STT3a的cDNA全長(zhǎng)序列定向克隆于原核表達(dá)載體pET-28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用SDS-PAGE方法，分析STT3a融合蛋白在大腸桿菌BL21中的表達(dá)情況。并通過(guò)Primer Premier5.0在STT3a結(jié)構(gòu)域中設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，分別提取不同鹽濃度培養(yǎng)條件及鞭毛再生狀態(tài)下的杜氏鹽藻cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析STT3a在杜氏鹽藻鹽誘導(dǎo)及鞭毛再生過(guò)程中的作

5、用。另外，運(yùn)用改進(jìn)的銀染法對(duì)杜氏鹽藻鞭毛及藻體進(jìn)行銀染，并根據(jù)公式V=(S2-S1)/t(其中V為相對(duì)生長(zhǎng)速率，S2和S1分別為相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鞭毛長(zhǎng)度平均值，t代表間隔時(shí)間)，最終求出杜氏鹽藻鞭毛再生不同時(shí)期的相對(duì)生長(zhǎng)速率。
　　 序列分析顯示克隆得到的杜氏鹽藻STT3a基因cDNA全長(zhǎng)序列為2574 bp，包括114 bp的5'UTR、279 bp的3'UTR以及2181 bp的開(kāi)放閱讀框(open readingframe

6、，ORF)，編碼727個(gè)氨基酸殘基，其蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為9.11，分子量為80.25 kDa。對(duì)所得氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，BLAST結(jié)果顯示，克隆所得的序列為杜氏鹽藻STT3a蛋白的基因序列。SDS-PAGE結(jié)果顯示：在80 kDa左右出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)測(cè)的蛋白分子量大小一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示杜氏鹽藻STT3a mRNA水平隨著鹽濃度的升高而逐漸增加，其水平在3.5mol/L，NaCl濃度時(shí)比在1.5 mol/L