杜氏鹽藻DsPLC基因的功能分析.pdf

1、杜氏鹽藻（Dunaliella salina以下簡稱鹽藻）是已知最為耐鹽的真核生物之一，但到目前為止，其耐鹽的分子機制及應(yīng)答鹽脅迫信號的分子途徑還不清楚。磷脂酶C（phospholipase C，簡稱PLC）能夠水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），產(chǎn)生兩個重要的第二信使。磷脂酰肌醇信號通路廣泛參與生物體內(nèi)多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，磷脂酶 C是該信號途徑中的關(guān)鍵酶，因此，深入探討鹽藻磷脂酶C的生物學(xué)特性及作用機制，對于闡明鹽藻應(yīng)答鹽脅

2、迫信號的分子途徑具有重要科學(xué)意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用RT-PCR技術(shù)擴增了DsPLC的開放閱讀框序列，構(gòu)建了原核表達載體pGS21a-DsPLC，將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達了融合蛋白，通過SDS-PAGE檢測，在上清和包涵體中都有融合蛋白的存在?？扇苄缘鞍捉?jīng)過GST純化柱純化，結(jié)果表明，在96 KD左右有單一的蛋白條帶，說明融合蛋白得到有效純化。蛋白印跡結(jié)果顯示在96

3、 KD左右有明顯的雜交條帶，初步證明純化的蛋白就是帶有GST標簽的磷脂酶C蛋白。⑵將鹽藻DsPLC開放閱讀框序列連接到帶有綠色熒光蛋白基因的亞細胞定位表達載體pMDCG上，成功構(gòu)建了亞細胞定位表達載體pMDCG-DsPLC，通過凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達載體導(dǎo)入洋蔥表皮細胞，使DsPLC在洋蔥表皮細胞中成功表達，明確了鹽藻磷脂酶C主要分布在細胞內(nèi)膜系統(tǒng)中。⑶將杜氏鹽藻DsPLC基因的開放閱讀框與酵母雙雜交誘餌表達載體p