杜氏鹽藻的RbcS基因及其調(diào)控區(qū)的克隆和功能鑒定.pdf

1、鄭博士州大學(xué)位”Ii781571授予單位代碼：10459研究生學(xué)號(hào)：0205J密級(jí)：公開學(xué)論文論文題目：杜氏鹽藻的RbcS基因及其調(diào)控區(qū)的克隆和功能鑒定作者姓名：學(xué)科門類：專業(yè)方向：導(dǎo)師姓名、職睬柴玉榮醫(yī)學(xué)基因工程薛樂勛研究員二零零五年五月鄭州大學(xué)2005博士學(xué)位論文物，以基因組步行文庫為模板，分離該基因的5’上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子區(qū)域。所得的DNA調(diào)控序列與報(bào)告基因除草劑抗性基因bar融合，構(gòu)建真核表達(dá)載體，用電擊法導(dǎo)入到杜氏鹽藻中。

2、用除草劑革丁膦(PhosphinothricinPPT)篩選轉(zhuǎn)化成功的藻株。通過研究RbcS基因的5’上游調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性以及在杜氏鹽藻遺傳轉(zhuǎn)化中的作用，為建立杜氏鹽藻生物反應(yīng)器提供高效的表達(dá)調(diào)控元件。一、杜氏鹽藻RbcS基因的克隆與分析1實(shí)驗(yàn)方法11RbeS基因部分序列的克隆根據(jù)萊茵衣藻、團(tuán)藻、玉米等真核生物的1，5一二磷酸核酮糖羧化酶，力Ⅱ氧酶(RuBisCO)小亞基RbcS基因的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)簡并引物。以杜氏鹽藻總R

3、NA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成eDNA第一鏈，再以此為模板，PCR擴(kuò)增RbcS基因的eDNA片段。RTPCR產(chǎn)物利用TA克隆方法，亞克隆到載體pMDl8一T卜，并測序。測序結(jié)果與GenBank上其他物種的RbcS基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并用BLAST進(jìn)行同源性分析。12RbeS基因全長eDNA序列的克隆及序列分析提取杜氏鹽藻細(xì)胞的總RNA，根據(jù)上述簡并引物擴(kuò)增出的杜氏鹽藻RbcS基因部分序列信息，利用5’RACE和3’RACE的方法分別

4、向5’上游和3’下游擴(kuò)增杜氏鹽藻RbeS基因的5’和3’eDNA末端片段。擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到載體pMDl8T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，對(duì)經(jīng)過篩選和鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。根據(jù)已經(jīng)得到的RbcS三段序列信息設(shè)計(jì)引物，重新利用RTPCR的方法，得到杜氏鹽藻的RbeS全長eDNA序列。分別使用Dnaman軟件、PrimerPrimier軟件以及GenBankBLAST檢索分析系統(tǒng)等對(duì)所擴(kuò)增的RbeS基因進(jìn)行氨基酸和核苷酸序列同源性以及密碼