鹽生杜氏藻錳超氧化物歧化酶（MnSOD）的基因克隆、表達與功能研究.pdf

1、超氧化物歧化酶(SOD)是一種能催化超氧自由基(O<'2->)發(fā)生歧化反應的金屬酶。由于超氧自由基(O<'2->)被認為對各種生物大分子及其它細胞組分具有嚴重的損傷作用，因此SOD被認為是體內對抗自由基的第一道防線，其分子生物學基礎及應用研究備受關注。按照結合金屬離子種類不同，目前已知的SOD主要有以下三種，即Fe-SOD,Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。其中，Mn-SOD多為誘導表達型，氧自由基對Mn-SOD的表達有顯著的誘導作用。

2、因此，Mn-SOD在機體適應環(huán)境變化，尤其在應對環(huán)境脅迫方面可能發(fā)揮重要作用。 鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)是高耐鹽性的單細胞真核綠藻，能在含飽和的NaCl培養(yǎng)液中生存，而且能夠在紫外輻射極強的青藏高原生存，具有較高的耐紫外線特性。通過比較幾種藍、綠藻粗酶液中的SOD，發(fā)現(xiàn)鹽藻Mn.SOD的比活性高達105.3U/m g，是螺旋藻的十幾倍，這在一般的藻類中是不多見的。本實驗對鹽藻體內MnSOD活性與外界脅迫的

3、關系做了研究，發(fā)現(xiàn)在不同的鹽脅迫、紫外脅迫和溫度脅迫下，鹽藻體內MnSOD活性與脅迫強度呈正相關。因此我們推測：杜氏鹽藻抗逆機制與MnSOD存在著聯(lián)系，鹽藻在耐鹽堿以及耐輻射能力上與其他物種巨大的差異很可能與鹽藻MnSOD的自身特性相關，比如含量的多少，酶活性質等，除此之外，也可能與基因在在受誘導后的表達量有關。因此，研究鹽生杜氏藻MnSOD基因及其蛋白功能夠幫助揭示鹽藻獨特的耐鹽等機理。 為了解決上述問題，本文開展了以下內容的

4、研究： 一、鹽生杜氏藻MnSOD與鹽、堿及紫外脅追聯(lián)系的生理實驗。針對鹽藻耐鹽、堿和抗紫外的特點，通過在鹽、堿和紫外脅迫環(huán)境下測定鹽藻粗酶中MnSOD的酶活，得出鹽藻MnSOD活性與鹽、堿和紫外脅迫條件呈正相關的結果，初步證實鹽藻MnSOD具有與抗逆相關的特性，為立題提供了有效的實驗依據(jù)。 二、克隆鹽生杜氏藻MnSOD基因的cDNA全長。通過同源克隆的方法，首先成功的克隆到鹽生杜氏藻MnSOD基因的一段EST序列，接著通

5、過5’RACE和3’RACE技術，獲得了其全長cDNA序列，命名為DsMnSOD。 三、對杜氏鹽藻MnSOD基因及其推演出的蛋白質序列進行相關的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)鹽藻MnSOD蛋白與大多數(shù)．MnSOD蛋白在結構和性質上的相同之處，進一步證實了MnSOD是一類比較保守的蛋白。 四、通過功能互補研究，證實了MnSOD蛋白在杜氏鹽藻耐鹽、抗紫外、抗寒和抗氧脅迫方面具有貢獻。通過構建表達載體pET32a-Mnsod，轉入大腸桿

6、菌SOD突變株K12，檢測蛋白在不同脅迫條件下對菌株的保護作用。結果顯示，鹽藻MnSOD具有抗逆功能，特別是其耐鹽和抗紫外功能突出，與杜氏鹽藻自身的抗逆特點相同，更加說明MnSOD在鹽藻抗逆機制中發(fā)揮著重要作用。 五、建立起DsMnSOD基因的原核表達體系，得到純化的融合蛋白，測定并分析其生理生化屬性，發(fā)現(xiàn)蛋白具有金屬酶特性，受Mn<'2+>調控表達，具有廣泛的pH耐受范圍(pH4～11)和較好的溫度耐受能力(在85℃水浴中酶活