弓形蟲(chóng)超氧化物歧化酶(SOD)基金分析和克隆表達(dá).pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，可以感染所有溫血?jiǎng)游?，包括人、家畜和海洋哺乳?dòng)物，引起人獸共患弓形蟲(chóng)病。在多數(shù)情況下，人感染弓形蟲(chóng)后沒(méi)有明顯的臨床癥狀，但是當(dāng)機(jī)體免疫低下時(shí)，弓形蟲(chóng)的感染可能會(huì)造成嚴(yán)重的后果。弓形蟲(chóng)嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，已引起醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)界的高度重視。所以，對(duì)弓形蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)病的研究具有十分重要的意義。
　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)廣泛存在于多種生物體內(nèi)，包括

2、植物、動(dòng)物、微生物等，在醫(yī)學(xué)、食品業(yè)、工業(yè)上有潛在的利用價(jià)值。超氧化物歧化酶亦普遍存在于弓形蟲(chóng)中，以往的研究表明，超氧化物歧化酶可能在弓形蟲(chóng)的胞內(nèi)生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。
　　方法:分別對(duì)十個(gè)弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株SOD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建相應(yīng)的重組克隆載體pEASY-SOD，經(jīng)DNA測(cè)序，獲得不同蟲(chóng)株來(lái)源的SOD基因序列;然后用限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性分析分型法(PCR-RFLP)和生物信息學(xué)的方法對(duì)弓形蟲(chóng)SOD基因序列進(jìn)行分析。同時(shí)，利用分

3、子克隆技術(shù)構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-SOD，經(jīng)PCR、酶切與測(cè)序鑒定正確后，體外轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，利用熒光顯微鏡、SDS-PAGE和Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:十個(gè)不同蟲(chóng)株來(lái)源的弓形蟲(chóng)SOD基因序列大約1700bp，PCR-RFLP酶切的結(jié)果顯示酶切片段是相同的;DNA測(cè)序結(jié)果顯示十個(gè)SOD序列之間有43個(gè)堿基和24個(gè)氨基酸改變，變異度在0到1％之間;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示10株弓形蟲(chóng)SOD序

4、列可以大致分為兩組，且各組間存在著很小的差異。上述結(jié)果表明弓形蟲(chóng)SOD具有高度保守性，可能是弓形蟲(chóng)DNA疫苗的靶點(diǎn)。另外，重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-SOD構(gòu)建正確，經(jīng)熒光顯微鏡、SDS-PAGE和Westernblotting鑒定，弓形蟲(chóng)SOD基因可以在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，并且具有一定的免疫活性。
　　結(jié)論:弓形蟲(chóng)SOD基因序列具有高度保守性，可能是弓形蟲(chóng)DNA疫苗的靶點(diǎn);成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-SOD，