超氧化物歧化酶在釀酒酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、鄭碩士論文題l：作者姓名：學(xué)科門類：專業(yè)名稱：導(dǎo)師姓名、職稱：學(xué)位授予單位代碼10459學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)?20812密級(jí)，當(dāng)于論文超氧化物歧化酶在釀灑酵母中的分泌表達(dá)李雪蓮醫(yī)學(xué)病原生物學(xué)武峰教授，黃留玉研究員，王恒梁副研究員2005年4月10日鄭卅l大學(xué)2005屆碩士論文超氧化物歧化酶在釀酒酵母中的分泌表達(dá)方法1釀酒酵母MF—d信號(hào)肽基因的PCR擴(kuò)增：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVScl的菌體

2、裂解液作為PCR模板，設(shè)計(jì)分別含有KpnI和BamHl酶切位點(diǎn)的上下游引物，PCR擴(kuò)增MF—o信號(hào)肽基因。2hCu／ZnSOD基因的PCR擴(kuò)增：用Qiagen公司的RneasyMinikit提取人胃組織總mRNA后用CASsuperTWO—STEPRT—PCRkit擴(kuò)增出的總eDNA為作為PCR模板。設(shè)計(jì)分別含有BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)的上下游引物，PCR擴(kuò)增hCu／Zn—SOD基因。3構(gòu)建克隆質(zhì)粒pUC—MS：將釀酒酵母MFa分泌

3、信號(hào)肽基因與hCu／Zn—SOD基因在克隆質(zhì)粒pUCl9中相連接，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。4構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒：質(zhì)粒pUCMS與質(zhì)粒pET22b()分別經(jīng)(BamHIHindIII)雙酶切，將hCu／Zn—SODcDNA重組到T7啟動(dòng)予控制下的分泌型表達(dá)載體pET22b()@，構(gòu)建了原核分泌表達(dá)質(zhì)粒pETSOD，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。5構(gòu)建真核分泌表達(dá)質(zhì)粒：質(zhì)粒pUC—MS與大腸桿菌酵母穿梭質(zhì)粒pYES20分別經(jīng)(KpnlXbaI)雙酶切，構(gòu)建真核

4、分泌表達(dá)質(zhì)粒pYESMS，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。6SOD在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)：將構(gòu)建好的pETSOD分泌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取lmL菌液超聲破碎后經(jīng)15％SDS—PAGE電泳、蛋白質(zhì)免疫印跡和NBT還原法活性染色定位分析。7SOD在釀酒酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)：將構(gòu)建好的真核分泌表達(dá)載體pYESMS用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl，該菌株為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型，能在SCUra選擇平板上生長(zhǎng)的酵母菌即

5、為含有重組質(zhì)粒的酵母。將正常轉(zhuǎn)化的酵母菌株pYES—MS／INV在搖瓶中進(jìn)行半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，陰性對(duì)照菌株為未經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)的pYESMS／INV，分別收集菌體和培養(yǎng)基上清制各樣品。菌體用玻璃珠破壁法抽提總蛋白，培養(yǎng)上清用超濾管濃縮100倍體積。將樣品分別經(jīng)15％SDSPAGE電泳、蛋白質(zhì)免疫印跡和NBT還原法活性染色定位分析。結(jié)果1以釀酒酵母為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約250bp的信號(hào)肽MFa基因片段；以人胃總eDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約