超氧化物歧化酶（SOD）在酵母系統(tǒng)中的表達(dá)研究.pdf

1、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)是一種廣泛存在于各類生物體中的抗氧化酶，是機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基(O<,2><,->)的天然消除劑，在防御O<,2><'->的毒性、抗炎、抗免疫性疾病、抗衰老以及預(yù)防腫瘤等方面起著重要的生理作用。其中，人EC-SOD是人體細(xì)胞外體液中最主要的SOD，在許多病理生理問題上都有著重要的應(yīng)用價(jià)值。中國擬青霉(Paecilomyces．sinensis)被認(rèn)為是珍貴的冬蟲夏草

2、的具有藥效的無性型之一，具有很好的抗氧化作用，其Cu，Zn-SOD極有可能成為有效的冬蟲夏草代用資源。 本論文首先利用已構(gòu)建好的重組原核表達(dá)載體pQE30-EC-SOD在大腸桿菌M15中誘導(dǎo)表達(dá)人EC-SOD蛋白，經(jīng)Ni-NTA技術(shù)純化后，作為抗原免疫大白兔，得到效價(jià)較高、特異性良好的EC-SOD多克隆抗體，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中重組EC-SOD表達(dá)產(chǎn)物的鑒定和純化。 同時(shí)本論文利用畢赤酵母(Pichia pastoris)表

3、達(dá)了重組人EC-SOD。首先將人EC-SOD基因克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-EC-SOD，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定、Zeocin抗性篩選得到含人EC-SOD基因的高拷貝轉(zhuǎn)化子。通過BMGY/BMMY搖瓶培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Western blot和SOD酶活力檢測(cè)，證明為具有較高酶活力的人EC-SOD蛋白，最高酶活達(dá)3976U/mg(鄰苯三酚自氧化

4、法)。通過正交試驗(yàn)，在pH值、離子添加和甲醇濃度三個(gè)因素上，對(duì)EC-SOD在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。此外，本論文還在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中食品級(jí)表達(dá)了中國擬青霉的Cu，Zn-SOD。將中國擬青霉Cu，Zn-SOD基因克隆至釀酒酵母表達(dá)載體oYES2/CT后，ApaLI和Nco I雙酶切去除載體上的Amp<'r>抗性基因和一段URA3片段，通過PCR擴(kuò)增、T4連接，把被切除的URA3片段重