耐熱錳超氧化物歧化酶的表達(dá)純化及其結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)農(nóng)科院張志芳老師實(shí)驗(yàn)室獲得一種耐熱MnSOD的基因，其全長(zhǎng)為615 bp，編碼204個(gè)氨基酸殘基，編碼的蛋白分子量預(yù)測(cè)為22.98 kD，等電點(diǎn)預(yù)測(cè)為5.57。
　　 為了探索MnSOD的酶學(xué)性質(zhì)，我們將MnSOD基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-6P-1中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)(37℃)表達(dá)后，通過(guò)SDS-PAGE和Western

2、blotting鑒定，上清樣品中均有一特異性條帶(融合標(biāo)簽后分別為26 kD和49 KD)，與預(yù)測(cè)值相符。通過(guò)超氧化物歧化酶測(cè)活試劑盒測(cè)得，His-MnSOD和MnSOD的酶活分別為1268U/mL和1752 U/mL。
　　 為探索MnSOD的結(jié)構(gòu)，我們通過(guò)親和層析的純化方法，得到純度在90％以上的目的蛋白，測(cè)得His-MnSOD和MnSOD的濃度分別為14.2 mg/mL和12.4mg/mL，通過(guò)懸滴法來(lái)點(diǎn)結(jié)晶，置于16℃結(jié)

3、晶室培養(yǎng)。通過(guò)一系列對(duì)結(jié)晶條件的摸索，確定His-MnSOD和MnSOD晶體生長(zhǎng)的最佳濃度分別為8 mg/mL和7mg/mL，其晶體對(duì)應(yīng)的X射線衍射分辨率分別為2.4 A和1.8 A。通過(guò)收集和分析MnSOD的晶體數(shù)據(jù)，已將MnSOD的晶體結(jié)構(gòu)完全解出，結(jié)果顯示：該酶為單體，含12個(gè)α-螺旋，3個(gè)β-折疊，酶活性中心含有一個(gè)錳離子和鎂離子。
　　 為了探索MnSOD的耐熱機(jī)制，將其結(jié)構(gòu)與人源MnSOD的結(jié)構(gòu)相比較，發(fā)現(xiàn)它們的蛋白

4、質(zhì)氨基酸序列有45％相同和61％的相似性。將兩者三維結(jié)構(gòu)的Cα重原子疊合發(fā)現(xiàn)它們的RMSD為0.7 A，這兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)的最大不同之處在于92-101位和137-140位的loop區(qū)的差異。
　　 此外，通過(guò)Bac to Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組病毒感染家蠶BmN細(xì)胞，通過(guò)Westernblotting鑒定，結(jié)果表明：耐熱MnSOD基因可以在BmN細(xì)胞中成功表達(dá)，從而也得出MnSOD基因可以在真核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)的結(jié)論。