嗜熱毛殼菌超氧化物歧化酶基因的克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性研究.pdf

1、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）能夠催化超氧陰離子（O2-）發(fā)生歧化反應(yīng)，在生物體防御氧化損傷的過程中，發(fā)揮著重要作用。根據(jù)酶分子中所含金屬輔基的不同，超氧化物歧化酶主要可分為Cu,Zn-SOD，Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD等類型。
　　 超氧化物歧化酶已在食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，具有重要商業(yè)價值。但市場應(yīng)用的超氧化物歧化酶主要來源于常溫生物，因此酶的半衰期短，熱穩(wěn)定性差

2、，儲存期短，導(dǎo)致產(chǎn)品成本高，而制約超氧化物歧化酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)中的應(yīng)用。由此可見，熱穩(wěn)定性超氧化物歧化酶的研究和開發(fā)具有重要意義。
　　 嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum CT2）是廣泛分布的，生長上限溫度較高的嗜熱真菌，從這種真菌中已分離了多種嗜熱酶，具有極大的研究和應(yīng)用價值。本研究通過RT-PCR和Tail-PCR從嗜熱毛殼菌中分離到了一個新的Mn-SOD酶基因，序列分析表明該基因全長cDNA序列為6

3、84bp，編碼227個氨基酸，具有信號肽。將該基因在畢赤酵母中表達(dá)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)6d后酶活最高可達(dá)1020U/ml，蛋白量達(dá)0.93mg/ml。經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換等步驟純化了該重組蛋白，SDS-PAGE顯示該重組蛋白大小約為22.7kDa，與推測的蛋白分子量相似。重組酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為60℃和6.0，該酶具有較高的熱穩(wěn)定性,70℃處理60min后，殘余酶活為71％。

4、
　　 本研究還從嗜熱毛殼菌中克隆了一種Cu,Zn-SOD基因并將其在畢赤酵母中進(jìn)行了高效表達(dá)。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)6d后酶活最高可達(dá)1660U/ml，蛋白量達(dá)1.54mg/ml。經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換等步驟純化了該重組蛋白，SDS-PAGE顯示該重組蛋白大小約為17 kDa，該重組酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為60℃和6.5。70℃處理60min后，殘余酶活為65％，在80和90

5、℃下的半衰期分別為22和7min。
　　 比較上述構(gòu)建的重組酵母GS115（pPIC9K/mnsod）和GS115（pPIC9K/czsod）與非重組酵母（pPIC9K）在不同濃度NaCl、百草枯、甲萘醌和H2O2脅迫下的生長狀況，驗(yàn)證嗜熱毛殼菌mnsod及czsod基因?qū)Σ煌巧锩{迫的抵抗能力。結(jié)果表明嗜熱毛殼菌mnsod及czsod基因?qū)Π}、百草枯、甲萘醌、過氧化物等多種脅迫具有抵抗能力。
　　 鹽脅迫是自然界

6、中主要的非生物脅迫之一，是影響植物生長發(fā)育的主要因素，鹽脅迫的適應(yīng)機(jī)制在許多模式生物中廣泛研究。利用基因工程技術(shù)提高植物耐鹽性是解決這一問題的最有效途徑之一。研究抗逆相關(guān)基因的抗逆功能是基因工程抗性育種的前提。當(dāng)植物遭受包括高鹽、干旱、低溫和高溫等環(huán)境脅迫時可產(chǎn)生大量活性氧?；钚匝踹M(jìn)而破壞細(xì)胞內(nèi)的大分子，從而使DNA裂解，造成膜的損傷或影響蛋白質(zhì)的合成及穩(wěn)定性等。因此，對植物來說有效的活性氧清除系統(tǒng)非常重要。
　　 植物的超氧化

7、物歧化酶活性與其在鹽脅迫下的防御能力密切相關(guān)。關(guān)于逆境脅迫下SOD活性增高的生理關(guān)系已有報道，表明植物體內(nèi)的SOD活性增高可以增強(qiáng)其對逆境脅迫的抵抗能力。到目前為止已報道多種轉(zhuǎn)SOD基因植物對鹽脅迫的抗性。
　　 為了驗(yàn)證鹽脅迫下嗜熱毛殼菌mnsod及czsod的基因功能，將mnsod及czsod基因分別構(gòu)建到35s啟動子驅(qū)動的植物表達(dá)載體pROKⅡ中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草。經(jīng)PCR、southern雜交和RT-PCR檢測表

8、明嗜熱毛殼菌的mnsod及czsod基因分別整合到煙草基因組中。
　　 通過分析高鹽脅迫下非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因煙草的種子萌發(fā)率表明，轉(zhuǎn)mnsod基因和轉(zhuǎn)czsod基因的煙草種子比野生型煙草種子的萌發(fā)率高，且兩種轉(zhuǎn)基因煙草的根生長受到的抑制都比野生型小。說明轉(zhuǎn)嗜熱毛殼菌sod基因提高了煙草在種子萌發(fā)及小苗生長階段的耐鹽性。
　　 鹽分脅迫會使植物膜系統(tǒng)受到傷害，導(dǎo)致植株的葉片MDA含量升高，膜脂過氧化作用增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中鹽脅迫處

9、理使轉(zhuǎn)基因植株與野生型植物葉片的丙二醛含量都有所上升，但兩種轉(zhuǎn)基因煙草植株的MDA含量顯著低于未轉(zhuǎn)基因植株。說明轉(zhuǎn)基因煙草膜脂過氧化程度低于野生型煙草，膜傷害程度較輕。該結(jié)果表明在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比具有明顯提高的抗鹽性。
　　 在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)mnsod基因和轉(zhuǎn)czsod基因煙草株系的SOD活性與野生型一樣都呈先升高后降低的趨勢，但兩種轉(zhuǎn)基因煙草SOD活性都比非轉(zhuǎn)基因煙草高的多。
　　 研究了兩種轉(zhuǎn)基因