褶紋冠蚌超氧化物歧化酶基因的原核表達(dá)及蛋白性質(zhì)研究.pdf

1、褶紋冠蚌(Cristaria plicata)作為我國(guó)重要的淡水育珠蚌之一,易受病原體感染而發(fā)生疾病,育珠能力產(chǎn)生了較大的影響,因此開展其分子免疫的研究具有重要意義。超氧化物歧化酶(SOD)能清除生物氧化過程中所產(chǎn)生活性氧(ROS)而對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究對(duì)褶紋冠蚌icCuZnSOD基因進(jìn)行了克隆和重組表達(dá)載體構(gòu)建,并對(duì)重組rCpSOD基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和純化,測(cè)定蛋白活性及穩(wěn)定性,并初步評(píng)估其功能。
　　 本文通過利

2、用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR的方法克隆出褶紋冠蚌CpSODcDNA全長(zhǎng),將基因和表達(dá)載體pET-30a經(jīng)Kpn I、EcoR I雙酶切之后,連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中,加入IPTG時(shí),同時(shí)加入或不加入Cu2+／Zn2+分別在37℃和20℃進(jìn)行誘導(dǎo),采用Ni2+親和層析鎳純化蛋白的方法,對(duì)包涵體和可溶蛋白分別進(jìn)行純化和活性測(cè)定,并考察活性最高rCpSOD蛋白酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)

3、定性和對(duì)變性劑的穩(wěn)定性。用rCpSOD小鼠抗血清對(duì)誘導(dǎo)的融合蛋白進(jìn)行Western-blot分析抗原性。最后建立乙醇損傷細(xì)胞的模型,探討rCpSOD對(duì)乙醇損傷人LO2肝細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 SDS-PAGE結(jié)果表明,37℃誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白主要是包涵體形式,而20℃誘導(dǎo)則能夠產(chǎn)生可溶性蛋白,并且在補(bǔ)充有Cu2+／Zn2+時(shí)有助于可溶rCpSOD的產(chǎn)生。進(jìn)一步的SOD酶活性分析表明,不管補(bǔ)充Cu2+／Zn2+誘導(dǎo)與否,在37℃和20

4、℃誘導(dǎo)的包涵體蛋白復(fù)性后活性都低于1000U／mg,且20℃比37℃誘導(dǎo)的包涵體蛋白活性低；20℃誘導(dǎo)產(chǎn)生的可溶蛋白酶活性則明顯升高,補(bǔ)充Cu2+／Zn2+誘導(dǎo)產(chǎn)生的rCpSOD酶活性最高,達(dá)5300 U／mg,說(shuō)明在低溫培養(yǎng)及補(bǔ)充Cu2+／Zn2+時(shí)有利于可溶rCpSOD的體外誘導(dǎo)表達(dá)并且有利于其酶活性的提高。純化的可溶性rCpSOD蛋白在溫度60℃和pn2-9內(nèi)活性穩(wěn)定,并可耐受8mol·L-1的尿素和8％的十二烷基硫酸鈉(SDS)