嗜熱子囊菌光孢變種熱穩(wěn)定超氧化物歧化酶的純化及基因克隆和表達(dá).pdf

1、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡(jiǎn)稱(chēng)SOD)(EC．1.15．1.1)系一類(lèi)金屬酶，廣泛存在于生物體中。它能夠催化超氧陰離子(O<,2>)發(fā)生歧化反應(yīng)，從而清除超氧陰離子。在生物體防御氧化損傷的過(guò)程中，發(fā)揮著重要作用。根據(jù)酶分子中所含金屬輔基的不同，超氧化物歧化酶主要可分為Cu，Zn-SOD(存在于真核生物)，Mn-SOD(存在于原核生物和真核生物)，F(xiàn)e-SOD(存在于原核生物和高等植物的葉綠體中)等類(lèi)型。M

2、n-SOD和Fe-SOD的氨基酸組成相似，可能起源于同一祖先。 嗜熱真菌產(chǎn)生的超氧化物歧化酶在高溫條件下具有高活力和穩(wěn)定性，并且與中溫真菌一樣，嗜熱真菌產(chǎn)生的超氧化物歧化酶普遍含有多種類(lèi)型的組分。嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus aurantiacus vat．levisporus)是一種廣泛分布的，生長(zhǎng)上限溫度較高的嗜熱真菌，能夠在45℃～50℃的高溫下很好的繁殖生長(zhǎng)，而絕大多數(shù)的真核生物若長(zhǎng)期暴露于40℃以上將無(wú)

3、法存活。本研究中T. auranttiacus vat．levisporus在含干酪素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生超氧化物歧化酶，通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子層析、．Phenvl-Sepharose疏水層析等步驟獲得了凝膠電泳均一的Cu，Zn-SOD。分別用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的方法和Sephacrvl S-100凝膠過(guò)濾層析的方法，測(cè)定出本研究所獲得的超氧化物歧化酶的分子量分別

4、為16.8kDa和33.2kDa。證明在本研究中所得到的超氧化物歧化酶是一種由相同的2個(gè)亞基所構(gòu)成的蛋白質(zhì)，同時(shí)對(duì)該酶進(jìn)行理化性質(zhì)的研究。 T. aurantiacus var.levisporus Cu，Zn-SOD的N-端7個(gè)氨基酸序列為VKAVAVL，與其它己報(bào)道的Claviceps purpurea，Paecilomvces sinensis andGlomerella cinfzulata的Cu，Zn-SOD N-端

5、氨基酸序列同源性較高，推測(cè)可能是一種新的Cu，zn-SOD。 根據(jù)T. aurantiacus var．levisporus Cu-Zn．SOD的N-端氨基酸序列和同源保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR．及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了該Cu，Zn-SOD的編碼基因，其全長(zhǎng)cDNA為705bp，包含一個(gè)由155個(gè)氨基酸組成的開(kāi)放閱讀框。該基因已在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為D0497636。 由

6、核苷酸序列推導(dǎo)的相應(yīng)N端氨基酸序列與測(cè)定的純酶N端序列完全一致，成熟肽大小預(yù)測(cè)為16 kDa。 將經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的Cu，Zn-SOD基因和原核表達(dá)載體pET-22b(+)進(jìn)行連接，構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET/czsod，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E coli BL21。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4～5h，目的蛋白得到大量表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，在約17 kDa處有一條明顯的蛋白帶，蛋白大小與從該SOD氨基酸序列估計(jì)的蛋白分