杜氏鹽藻環(huán)盒子1互作蛋白的篩選及功能初探.pdf

1、環(huán)盒子1(Ring-box l, RBX1)是SCF-E3泛素-蛋白連接酶復合體中的指環(huán)亞基，通過靶向降解不同的底物蛋白而發(fā)揮調(diào)節(jié)多種細胞生物學過程的作用。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是有機體細胞內(nèi)選擇性靶向降解蛋白質(zhì)的重要途徑,對機體面臨環(huán)境應激時維持穩(wěn)態(tài)具有相當重要的意義。當 UPS對靶蛋白的降解功能發(fā)生異常時,可能會引起抑癌蛋白異常降解、癌蛋白聚集、增殖加速、突變細胞的凋亡受

2、阻等,從而誘導腫瘤的發(fā)生發(fā)展。RBX1是SCF泛素-蛋白連接酶E3的重要組成部分，逐漸受到研究腫瘤學者的重視。RBX1存在于動植物的細胞質(zhì)和細胞核中，進化上比較保守。不同物種中RBX1家族的蛋白質(zhì)含有108~121個氨基酸，分子量約為12~16 kDa。人RBX1包含一個環(huán)指-H2結(jié)構(gòu)域，對鋅離子結(jié)合和泛素連接是必需的。作為泛素連接酶 E3的重要組成部分，RBX1在腫瘤發(fā)生時表達異常而無法起到調(diào)節(jié)作用，不能誘導腫瘤細胞的凋亡和衰老，在腫

3、瘤發(fā)生發(fā)展過程中至關重要，但具體分子機制尚不是很明確。
　　鞭毛（flagellum）/纖毛(cilium)在進化上異常保守，不僅可以作為運動推動器，還可以接收其他細胞以及外界環(huán)境的物理和化學信號，并傳遞到細胞內(nèi)從而引起細胞反應。鞭毛/纖毛功能和結(jié)構(gòu)上的異常能夠?qū)е乱幌盗斜廾?纖毛相關疾病的發(fā)生。目前關于鞭毛/纖毛組裝與解聚及“鞭毛/纖毛相關疾病”發(fā)生機理的認識，大多是通過對模式生物的遺傳學研究獲得的，這是由于直接以人類細胞作為研

4、究對象進行鞭毛/纖毛相關研究相當困難。杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種極度耐鹽的真核單細胞藻類，無細胞壁，生長周期短，易培養(yǎng)，具有等長的一對雙鞭毛，非常適合作為研究鞭毛結(jié)構(gòu)組裝的模式生物。本實驗室前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，RBX1的轉(zhuǎn)錄片段在鞭毛再生過程中，表達量明顯下調(diào)，但具體分子機制還需進一步研究。
　　為初步探究杜氏鹽藻RBX1在鞭毛再生過程中的分子調(diào)控機制，本實驗擬構(gòu)建RBX1的酵母誘餌表達載體pGBKT

5、7-rbx1，利用酵母雙雜交技術(shù)，從本課題組構(gòu)建的杜氏鹽藻鞭毛再生cDNA酵母文庫中篩選能夠與鹽藻RBX1相互作用的蛋白并驗證其相互作用，初步研究互作蛋白在杜氏鹽藻鞭毛調(diào)控中的作用。為深入研究RBX1在鞭毛調(diào)控中的生物學功能奠定基礎。
　　方法:
　　1、酵母雙雜交篩選杜氏鹽藻RBX1的互作蛋白及相互作用驗證
　　PCR擴增杜氏鹽藻rbx1的開放閱讀框，測序驗證后插入酵母表達質(zhì)粒構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-rbx1。將酶

6、切鑒定正確的誘餌載體，用PEG/LiAc法分別轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187和AH109中，通過表型篩選檢測RBX1對酵母菌株有無自激活和毒性作用，鑒定誘餌質(zhì)粒pGBKT7, pGBKT7-rbx1是否適用于酵母雙雜交方法。隨后，將轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-rbx1的 Y187菌株與文庫菌 AH109雜交，待三葉草形合子形成后用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和α-半乳糖苷酶活性實驗篩選杜氏鹽藻RBX1的互作蛋白，獲得陽性克隆。并將提取的酵母質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共

7、轉(zhuǎn)化酵母細胞AH109中進行回交實驗驗證互作蛋白的相互作用。
　　2、互作蛋白在杜氏鹽藻鞭毛再生調(diào)控過程中的表達變化
　　運用機械法脫去對數(shù)生長期杜氏鹽藻的雙鞭毛，然后在鞭毛再生過程中不同時間點收集藻細胞，以未脫鞭毛的藻細胞為對照，以鹽藻GAPDH作為內(nèi)參，用實時熒光定量PCR的方法檢測互作蛋白在鞭毛再生過程中的相對表達量。
　　結(jié)果:
　　酵母雙雜交篩選RBX1的互作蛋白
　　擴增得到杜氏鹽藻rbx1的開

8、放閱讀框，測序驗證后連入pGBKT7，成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌表達載體pGBKT7-rbx1。隨后轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109和Y187中，經(jīng)過毒性實驗和自激活作用的驗證，誘餌表達載體pGBKT7-rbx1對宿主酵母細胞即沒有毒性，也沒有自激活作用，證明適用于酵母雙雜交實驗。
　　以pGBKT7-rbx1為酵母雙雜交誘餌表達載體從杜氏鹽藻鞭毛再生cDNA酵母文庫中共篩選得到298個陽性單克隆，最后篩選得到的是603 bp的基因片段。經(jīng)測序

9、鑒定和同源性比對分析，該基因與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基同源性分別為38％和39％，故稱之為類氧化還原酶鐵硫蛋白亞基（Ds ferredoxin thioredoxin reductase subunit，DsFTR subunit）。用實時熒光定量PCR的方法檢測該亞基在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中 mRNA相對表達量的變化（P﹤0.001），結(jié)果表明在鞭毛再生1~3 h內(nèi)表達量呈上升趨勢，3 h時達到最大值，隨后表達量下降。

10、將酵母雙雜交獵物質(zhì)粒pGADT7-DsFTR與已構(gòu)建的酵母雙雜交誘餌表達載體pGBKT7-rbx1共轉(zhuǎn)化酵母細胞AH109中，觀察發(fā)現(xiàn)其在酵母固體營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上狀態(tài)良好，并用 X-α-gal進行藍白斑篩選，結(jié)果呈藍色，此回交實驗證實杜氏鹽藻RBX1與氧化還原酶鐵硫蛋白亞基在酵母細胞中存在相互作用。
　　結(jié)論:
　　利用酵母雙雜交技術(shù)，在杜氏鹽藻中成功篩選得到RBX1互作蛋白類氧化還原酶鐵硫蛋白亞基，并通過回交實驗進行了進