杜氏鹽藻環(huán)盒子1互作蛋白的篩選及功能初探.pdf

1、環(huán)盒子1(Ring-box l, RBX1)是SCF-E3泛素-蛋白連接酶復(fù)合體中的指環(huán)亞基，通過靶向降解不同的底物蛋白而發(fā)揮調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過程的作用。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)選擇性靶向降解蛋白質(zhì)的重要途徑,對機(jī)體面臨環(huán)境應(yīng)激時(shí)維持穩(wěn)態(tài)具有相當(dāng)重要的意義。當(dāng) UPS對靶蛋白的降解功能發(fā)生異常時(shí),可能會(huì)引起抑癌蛋白異常降解、癌蛋白聚集、增殖加速、突變細(xì)胞的凋亡受

2、阻等,從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。RBX1是SCF泛素-蛋白連接酶E3的重要組成部分，逐漸受到研究腫瘤學(xué)者的重視。RBX1存在于動(dòng)植物的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，進(jìn)化上比較保守。不同物種中RBX1家族的蛋白質(zhì)含有108~121個(gè)氨基酸，分子量約為12~16 kDa。人RBX1包含一個(gè)環(huán)指-H2結(jié)構(gòu)域，對鋅離子結(jié)合和泛素連接是必需的。作為泛素連接酶 E3的重要組成部分，RBX1在腫瘤發(fā)生時(shí)表達(dá)異常而無法起到調(diào)節(jié)作用，不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和衰老，在腫

3、瘤發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要，但具體分子機(jī)制尚不是很明確。
　　鞭毛（flagellum）/纖毛(cilium)在進(jìn)化上異常保守，不僅可以作為運(yùn)動(dòng)推動(dòng)器，還可以接收其他細(xì)胞以及外界環(huán)境的物理和化學(xué)信號(hào)，并傳遞到細(xì)胞內(nèi)從而引起細(xì)胞反應(yīng)。鞭毛/纖毛功能和結(jié)構(gòu)上的異常能夠?qū)е乱幌盗斜廾?纖毛相關(guān)疾病的發(fā)生。目前關(guān)于鞭毛/纖毛組裝與解聚及“鞭毛/纖毛相關(guān)疾病”發(fā)生機(jī)理的認(rèn)識(shí)，大多是通過對模式生物的遺傳學(xué)研究獲得的，這是由于直接以人類細(xì)胞作為研

4、究對象進(jìn)行鞭毛/纖毛相關(guān)研究相當(dāng)困難。杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種極度耐鹽的真核單細(xì)胞藻類，無細(xì)胞壁，生長周期短，易培養(yǎng)，具有等長的一對雙鞭毛，非常適合作為研究鞭毛結(jié)構(gòu)組裝的模式生物。本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，RBX1的轉(zhuǎn)錄片段在鞭毛再生過程中，表達(dá)量明顯下調(diào)，但具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
　　為初步探究杜氏鹽藻RBX1在鞭毛再生過程中的分子調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建RBX1的酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT

5、7-rbx1，利用酵母雙雜交技術(shù)，從本課題組構(gòu)建的杜氏鹽藻鞭毛再生cDNA酵母文庫中篩選能夠與鹽藻RBX1相互作用的蛋白并驗(yàn)證其相互作用，初步研究互作蛋白在杜氏鹽藻鞭毛調(diào)控中的作用。為深入研究RBX1在鞭毛調(diào)控中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、酵母雙雜交篩選杜氏鹽藻RBX1的互作蛋白及相互作用驗(yàn)證
　　PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻rbx1的開放閱讀框，測序驗(yàn)證后插入酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-rbx1。將酶

6、切鑒定正確的誘餌載體，用PEG/LiAc法分別轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187和AH109中，通過表型篩選檢測RBX1對酵母菌株有無自激活和毒性作用，鑒定誘餌質(zhì)粒pGBKT7, pGBKT7-rbx1是否適用于酵母雙雜交方法。隨后，將轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-rbx1的 Y187菌株與文庫菌 AH109雜交，待三葉草形合子形成后用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和α-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)篩選杜氏鹽藻RBX1的互作蛋白，獲得陽性克隆。并將提取的酵母質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共

7、轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109中進(jìn)行回交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證互作蛋白的相互作用。
　　2、互作蛋白在杜氏鹽藻鞭毛再生調(diào)控過程中的表達(dá)變化
　　運(yùn)用機(jī)械法脫去對數(shù)生長期杜氏鹽藻的雙鞭毛，然后在鞭毛再生過程中不同時(shí)間點(diǎn)收集藻細(xì)胞，以未脫鞭毛的藻細(xì)胞為對照，以鹽藻GAPDH作為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測互作蛋白在鞭毛再生過程中的相對表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　酵母雙雜交篩選RBX1的互作蛋白
　　擴(kuò)增得到杜氏鹽藻rbx1的開

8、放閱讀框，測序驗(yàn)證后連入pGBKT7，成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體pGBKT7-rbx1。隨后轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109和Y187中，經(jīng)過毒性實(shí)驗(yàn)和自激活作用的驗(yàn)證，誘餌表達(dá)載體pGBKT7-rbx1對宿主酵母細(xì)胞即沒有毒性，也沒有自激活作用，證明適用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。
　　以pGBKT7-rbx1為酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體從杜氏鹽藻鞭毛再生cDNA酵母文庫中共篩選得到298個(gè)陽性單克隆，最后篩選得到的是603 bp的基因片段。經(jīng)測序

9、鑒定和同源性比對分析，該基因與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基同源性分別為38％和39％，故稱之為類氧化還原酶鐵硫蛋白亞基（Ds ferredoxin thioredoxin reductase subunit，DsFTR subunit）。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測該亞基在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中 mRNA相對表達(dá)量的變化（P﹤0.001），結(jié)果表明在鞭毛再生1~3 h內(nèi)表達(dá)量呈上升趨勢，3 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后表達(dá)量下降。

10、將酵母雙雜交獵物質(zhì)粒pGADT7-DsFTR與已構(gòu)建的酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體pGBKT7-rbx1共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109中，觀察發(fā)現(xiàn)其在酵母固體營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上狀態(tài)良好，并用 X-α-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，結(jié)果呈藍(lán)色，此回交實(shí)驗(yàn)證實(shí)杜氏鹽藻RBX1與氧化還原酶鐵硫蛋白亞基在酵母細(xì)胞中存在相互作用。
　　結(jié)論:
　　利用酵母雙雜交技術(shù)，在杜氏鹽藻中成功篩選得到RBX1互作蛋白類氧化還原酶鐵硫蛋白亞基，并通過回交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)