大豆疫霉G蛋白α亞基互作蛋白的篩選及功能分析.pdf

1、大豆疫霉(Phytophthorasojae)作為十分重要的植物病原卵菌之一，在大豆生產(chǎn)中引起毀滅性的病害——大豆疫霉根腐病。大豆疫霉無性生活史階段產(chǎn)生孢子囊，釋放游動孢子。在田間傳播過程中，游動孢子識別寄主分泌的化學(xué)信號，定向游動定殖完成對寄主植物的侵染。因此，了解大豆疫霉游動孢子趨化性的分子調(diào)控機(jī)制，可以為有效的病害防控策略提供新的思路及方向。
　　大豆疫霉G蛋白α亞基互作蛋白的篩選。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉G蛋白α亞基能

2、夠調(diào)控游動孢子對大豆根部釋放的異黃酮的趨化性，揭示了G蛋白信號途徑在大豆疫霉孢子囊形成和游動孢子行為方面具有一定的作用。為了了解大豆疫霉G蛋白α亞基通過調(diào)控哪些基因從而在G蛋白信號途徑中起作用，我們利用酵母雙雜交技術(shù)在大豆疫霉cDNA文庫中篩選Gα亞基的互作蛋白。通過多次實驗并對結(jié)果的初步驗證，我們篩選得到了一個能夠與Gα互作的激活態(tài)蛋白激酶C受體(ReceptorofActivatedProteinKinaseC)。通過序列比對分析，

3、該蛋白的同源基因為擬南芥中的AtRACK1，因此我們將該基因命名為PsRACK1。
　　PsRACK1與Gα亞基一對一互作驗證。在G蛋白信號途徑中，Gα亞基存在激活與非激活兩種不同形態(tài)。報道證明將非激活態(tài)Gα亞基R117位和Q203位的保守氨基酸精氨酸和谷氨酰胺替換為組氨酸和亮氨酸，可以破壞Gα亞基的GTP酶活性將其鎖定在與GTP結(jié)合的激活狀態(tài)。為了驗證PsRACK1是否與兩種形態(tài)的Gα蛋白均能夠互作，我們分別用酵母雙雜交和GST

4、Pull-down體外互作驗證技術(shù)對PsRACK1與PsGPA1和PsGPA1(R177H,Q203L)進(jìn)行互作驗證。兩種實驗技術(shù)所得結(jié)果均表明:PsRACK1能夠與非激活態(tài)的PsGPA1直接互作，而與激活態(tài)的PsGPA1(R177H，Q203L)不能直接互作。
　　大豆疲霉PsRACK1功能研究。為了了解PsRACK1在大豆疫霉中的功能，本文采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法對PsRACK1進(jìn)行沉默，得到兩個沉默轉(zhuǎn)化子。對PsRA