大豆疫霉致病必需的RxLR效應(yīng)因子的鑒定和功能分析.pdf

1、疫霉屬于卵菌，其中許多能夠引起植物的毀滅性病害，如大豆疫霉為害大豆引起大豆疫霉根腐病。作為一種典型的半活體營養(yǎng)病原菌，大豆疫霉在侵染早期需要寄生于活體細(xì)胞來汲取營養(yǎng)，待侵染后期殺死寄主從而轉(zhuǎn)化為死體營養(yǎng)，在整個過程中，病原菌利用復(fù)雜的分子機(jī)制來調(diào)控與寄主的相互作用。隨著大豆疫霉基因組測序的完成，分析發(fā)現(xiàn)其基因組編碼大量的效應(yīng)因子，其中包括近400個RxLR類效應(yīng)因子。盡管一些RxLR類效應(yīng)因子已被發(fā)現(xiàn)能夠抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)，但絕大部分效

2、應(yīng)因子在侵染過程中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制仍然未知。
　　疫霉菌與真菌具有不同的進(jìn)化關(guān)系，在致病機(jī)制方面顯著的不同是疫霉菌分泌大量的RxLR類效應(yīng)因子。然而，疫霉菌眾多效應(yīng)因子中是否存在功能冗余或者是否大部分單個效應(yīng)因子都能夠決定病原菌的致病性尚且未知。基于實(shí)驗室前期的MicroArray數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)一步對RxLR類效應(yīng)因子進(jìn)行了侵染階段的轉(zhuǎn)錄分析，選取了17個在疫霉菌侵染早期上調(diào)表達(dá)的基因。將體外合成的double-stran

3、dedRNA(dsRNA)通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大豆疫霉(P6497)細(xì)胞中，介導(dǎo)候選效應(yīng)因子基因的瞬時沉默，并分析沉默突變體的致病性。共沉默并測試了17個侵染階段高表達(dá)的效應(yīng)因子。實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中13個RxLR效應(yīng)因子的基因沉默分別導(dǎo)致了大豆疫霉不同程度的致病能力喪失，表明這些侵染過程中轉(zhuǎn)錄上調(diào)的效應(yīng)因子對大豆疫霉致病能力的重要性，也說明了疫霉菌眾多效應(yīng)因子中大部分單個效應(yīng)因子都能起到對病原菌致病性的決定作用。
　

4、　病原菌在與植物的協(xié)同進(jìn)化中，RNA沉默是植物、真菌以及無脊椎動物等抵御病毒侵染的重要機(jī)制。本實(shí)驗室前期發(fā)現(xiàn)大豆疫霉兩個RxLR效應(yīng)因子(PSR1和PSR2)具有植物RNA沉默抑制子的活性，其中PSR2通過特異性抑制植物的tasi-RNAs來發(fā)揮作用。本研究在前人對PSR2進(jìn)行瞬時沉默的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行穩(wěn)定沉默，明確了PSR2也是大豆疫霉致病必需的效應(yīng)因子之一。此外，Kuan等進(jìn)一步分析可能影響PSR2功能的植物蛋白，本研究針對候選蛋白

5、進(jìn)行基因表達(dá)的分析，結(jié)果顯示目標(biāo)基因在野生型大豆疫霉侵染大豆過程中上調(diào)表達(dá)，而沉默PSR2的大豆疫霉侵染過程中轉(zhuǎn)錄則不再變化。通過對PSR2蛋白結(jié)構(gòu)域的解析，我們發(fā)現(xiàn)PSR2具有5個完整的W-Y-L元件和2個靠近兩端的不完整元件，實(shí)驗表明位于兩端的兩個不完整元件和靠近C端的1個完整的W-Y-L元件對其RNA沉默抑制活性是必需的，但單獨(dú)缺失上述任何一部分元件均對PSR2蛋白的亞細(xì)胞定位沒有影響。
　　綜上所述，本研究利用大豆疫霉的瞬

6、時轉(zhuǎn)化對17個在疫霉菌侵染大豆過程中上調(diào)表達(dá)的RxLR效應(yīng)因子進(jìn)行沉默，研究結(jié)果說明了疫霉菌中大部分單個效應(yīng)因子都能對病原菌致病性起到?jīng)Q定作用。此外，對具有植物RNA沉默抑制子活性的RxLR效應(yīng)因子PSR2進(jìn)行深入研究，明確了PSR2也是大豆疫霉致病必需的效應(yīng)因子之一，并鑒定了決定PSR2蛋白維持RNA沉默抑制子活性的關(guān)鍵功能域。本研究對理解疫霉菌眾多效應(yīng)因子存在的生物學(xué)意義以及效應(yīng)因子功能域與功能之間的關(guān)系具有重要價值，為深入研究效應(yīng)