大豆疫霉RxLR效應(yīng)分子Avh241的功能研究.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根莖腐病是威脅全世界大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一，每年導致全球十幾億美元的直接經(jīng)濟損失。研究大豆疫霉侵染大豆過程中效應(yīng)分子的作用機制對于進一步揭示在與寄主互作過程中的病原菌的侵染機制非常重要。大豆疫霉基因組中有將近400個RxLR效應(yīng)分子，研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)分子的RxLR motif可以與植物細胞膜上的PI3P結(jié)合，幫助效應(yīng)分子進入寄主細胞內(nèi)。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些效應(yīng)分子能夠在植物細胞內(nèi)

2、發(fā)揮毒性功能，抑制植物的免疫反應(yīng)，幫助病原菌的侵染。
　　 本實驗室之前對大豆疫霉RxLR效應(yīng)分子的功能進行大規(guī)模的篩選，發(fā)現(xiàn)大多效應(yīng)分子都能夠抑制植物的細胞死亡，也有部分效應(yīng)分子可以直接誘導植物免疫反應(yīng)。在侵染初期顯著上調(diào)表達的效應(yīng)分子主要作用是抑制植物對病原菌識別產(chǎn)生的PTI(PAMP-triggered immunity)，組成型高表達的效應(yīng)分子則與抑制ETI(Effector-triggeredimmunity)有關(guān)，效

3、應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄的精確編程對于大豆疫霉的致病性非常重要，效應(yīng)分子之間相互協(xié)作以“團隊作戰(zhàn)”的方式干擾植物的抗病反應(yīng)，促進病原菌的侵染。
　　 本研究綜合之前對于大豆疫霉效應(yīng)分子功能的大規(guī)模篩選結(jié)果，挑選出了15個RxLR效應(yīng)分子進行進一步分析。首先通過Solexa數(shù)據(jù)庫對這些效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄水平進行分析，發(fā)現(xiàn)有幾個效應(yīng)分子通過Solexa檢測不到表達，其余的都在侵染初期有不同程度的上調(diào)表達，說明這些效應(yīng)分子在侵染初期對病原菌侵染和定殖可能

4、有重要的作用。在植物細胞中瞬時表達這些效應(yīng)蛋白與GFP的融合蛋白，進行亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)分子Avh18、Avh94、Avh97、Avh172、Avh244、Avh247、Avh256和Avh260定位在植物細胞質(zhì)和細胞質(zhì)核中;效應(yīng)分子Avh23、Avh52和Avh240定位在植物的細胞核中;另外，效應(yīng)分子Avh181和Avh241定位在植物的細胞膜上。
　　 大豆疫霉的不同效應(yīng)分子在植物中的亞細胞定位具有多樣性，這種定位的

5、多樣性決定了效應(yīng)分子在植物細胞中作用的多樣性。其中，能夠在煙草上引起強烈壞死反應(yīng)的效應(yīng)分子Avh241在煙草細胞、洋蔥表皮細胞以及擬南芥原生質(zhì)體中都定位于細胞膜上。同時，通過在大豆、番茄、擬南芥上瞬時表達Avh241都能夠誘導細胞死亡。生物信息學分析比對發(fā)現(xiàn)Avh241蛋白與已知蛋白序列無明顯同源性。通過對十幾種不同大豆疫霉小種中的Avh241基因進行克隆測序比對發(fā)現(xiàn)，其在種內(nèi)很保守，沒有序列多態(tài)性。同時，我們對Avh241的不同突變體

6、進行功能分析，發(fā)現(xiàn)Avh241的59到168位氨基酸對于引起細胞死亡的功能是必須的。Avh241蛋白的N端6個氨基酸GAAKAK決定了蛋白的膜定位，且膜定位與引起細胞死亡的功能密切相關(guān)。
　　 Avh241能夠引起多種植物的細胞死亡，所以這種細胞死亡是廣譜性的。通過在不合抗病基因和含有不同抗病基因的大豆品種上瞬時表達Avh241，發(fā)現(xiàn)均能夠引起細胞死亡，說明這種細胞死亡是不依賴于目前已發(fā)現(xiàn)的大豆抗病基因的。Avh241能夠引發(fā)擬

7、南芥的突變體rpm1，sgt1b和rar1的原生質(zhì)體細胞死亡，說明被識別的途徑也不依賴于Rpm1，SGT1b和RAR1。在真核生物中，MAPK級聯(lián)反應(yīng)信號途徑非常保守，是PTI和ETI信號傳導的主要途徑之一。利用病毒誘導的基因沉默的方式將煙草中的APKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK、NTF6、WRKY1和WRKY2等幾個與MAPK途徑相關(guān)的基因沉默后，在煙草上瞬時表達Avh241，發(fā)現(xiàn)MAPKKKα、MEK1、SIPK、

8、NTF6、WRKY1和WRKY2等六個基因沉默后不影響細胞死亡的產(chǎn)生，而MEK2和WIPK沉默后，細胞死亡明顯降低。以上結(jié)果說明，Avh241被植物識別引起的細胞死亡是不通過R基因及SGT1b和RAR介導的，而是依賴MAPK級聯(lián)途徑中的MEK2和WIPK信號途徑。
　　 Avh241在大豆疫霉侵染寄主的初期上調(diào)表達，這說明Avh241在侵染過程中應(yīng)該有比較重要的作用。為了確定在侵染寄主大豆時，Avh241對大豆疫霉毒性的貢獻，我

9、們利用PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將大豆疫霉中的Avh241基因進行沉默，得到了三個沉默轉(zhuǎn)化子。對致病性測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子致病力下降。這表明在侵染過程中，Avh241具有毒性功能。為了進一步驗證Avh241的毒性功能，我們在煙草中瞬時表達Avh241（通過Avh172抑制其誘導的細胞死亡活性），能夠促進辣椒疫霉對煙草的侵染。通過檢測Avh241的突變體Avh241-4(80-188aa)，發(fā)現(xiàn)它也能夠促進辣椒疫霉對煙草的侵染。Avh241