辣椒疫霉中兩個RxLR效應因子的功能與作用機制研究.pdf

1、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）是一類重要的病原卵菌，其寄主廣泛，能夠侵染茄科（辣椒，番茄）、豆科（利馬豆，豆角）和大部分瓜類等植物并能造成毀滅性的災害。現(xiàn)階段，針對該病害的防治還缺乏有效的措施，由于辣椒疫霉菌容易變異且病害流行蔓延速度快，生產上使用的一些殺菌劑往往達不到很好的效果。那么，從辣椒疫霉的致病機理入手，尋找有效的作用靶標對該防治病害至關重要。
　　辣椒疫霉為半活體營養(yǎng)菌，在活體營養(yǎng)階段會分泌一系列效

2、應因子來調控植物的免疫防衛(wèi)反應從而促進其侵染定殖。在種類多樣的外泌蛋白物中，一類與致病性相關的細胞質效應因子被發(fā)現(xiàn)。該類效應因子的N端具有RxLR-dEER基序和信號肽結構域，起著分泌和靶定寄主細胞內蛋白的功能，而其C端是功能活性區(qū)，有調控寄主防衛(wèi)反應的作用。明確此類效應因子的功能和作用機制有利于揭示疫霉菌致病的分子機制，并為進一步利用抗病基因工程方法開發(fā)疫霉病害的防控策略提供科學依據。
　　我們通過辣椒疫霉侵染階段的轉錄組測序、

3、生物信息學分析預測以及農桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng)等對效應因子的功能進行分析，篩選得到了一個能夠引起煙草細胞死亡的細胞質效應因子PcRxLR207和一個能夠促進辣椒疫霉侵染的細胞質效應因子PcRxLR103，并對這兩個效應因子展開作用機制的研究，結果如下:
　　PcRxLR207具有誘導細胞死亡活性，其靶標蛋白為RBPs:通過對多個辣椒疫霉效應因子進行功能鑒定，我們發(fā)現(xiàn)PcRxLR207能夠在煙草上引起細胞死亡。為明確其在植物體內的作

4、用位點，我們通過亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)PcRxLR207僅分布在細胞質中。為了深入了解PcRxLR207的作用機理，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)去釣取擬南芥基因cDNA文庫，得到了可能與PcRxLR207互作的靶標基因BPA11、RRMP1、RRMP2和RRMP3。經NCBI數據庫比對及生物信息學預測分析，靶標基因均具有保守的RNA-binding motif,均可能表達RNA-binding proteins(RBPs)。在此基礎上我們通過兩種

5、公認的互作驗證系統(tǒng)酵母雙雜交(Y2H)和雙分子熒光互補(BiFC)驗證得到PcRxLR207能夠與RBPs直接互作，并且互作位點在細胞質中。另外，對RBPs進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，RBPs在細胞核和細胞質中都有分布。通過以上實驗，我們發(fā)現(xiàn)兩蛋白單獨定位和相互作用后的位點的轉移，推測PcRxLR207可能通過改變RBPs的定位來降低其活性從而導致植物生長異常，促進辣椒疫霉的侵染。
　　PcRxLR103能夠促進辣椒疫霉的侵染，并在侵染初

6、期和后期發(fā)揮著重要作用:本章從辣椒疫霉菌中成功克隆了多個RxLR效應因子，并將其構建到病毒表達載體PVX。利用農桿菌介導的植物瞬時表達系統(tǒng)，在本氏煙葉片中分別瞬時表達這幾個效應因子后再接種辣椒疫霉菌，獲得了一個能夠顯著促進疫霉菌侵染的效應因子PcRxLR103。實時定量PCR分析結果表明PcRxLR103在侵染階段上調表達，表明其在侵染過程中可能發(fā)揮重要作用。細胞死亡誘導實驗結果顯示PcRxLR103可以誘導微弱的植物細胞死亡，然而該細

7、胞死亡誘導活性與促進病原菌侵染的毒性功能之間的關系尚不明確，推測其可能通過抑制植物的防衛(wèi)反應來促進病原菌的侵染。為明確其作用機理，一方面我們通過花序浸染方法和FAST技術，將PcRxLR103轉化進入擬南芥植物中并通過熒光顯微鏡篩選得到可以激發(fā)綠色熒光的轉基因種子T0代。同樣，通過種植，收獲，篩選等步驟，可培育至T3代，獲得穩(wěn)定遺傳植株。利用轉有PcRxLR103基因的擬南芥植株，可以開展基因功能、信號通路等的研究。另一方面我們通過酵母