辣椒疫霉兩個重要基因(Pcpel2和MaoC-like dehydratase)的功能及晶體學研究.pdf

1、作為一種世界性土傳病害，辣椒疫病嚴重影響世界各國的辣椒生產，造成了巨大的經濟損失。該病由辣椒疫霉菌（Photophthora capsici
　　 Leonian）引起，它是一種土傳卵菌，以卵孢子或厚垣孢子在土壤及病殘體中越冬，可以存活數(shù)月甚至更長時間。該病可以在任何生長季節(jié)侵染寄主植物引起種苗死亡、莖腐、枯萎、果實腐爛；寄主范圍廣，可以侵染辣椒、西葫蘆、黃瓜、茄子、番茄等20多種作物。
　　 細胞壁降解酶是關鍵的病害致

2、病因子之一，包括角質酶（cutinase），果膠酶（pectinase），纖維素酶（cellulase），半纖維素酶（hemicellulase），蛋白酶（protease）等。而果膠酶又包括多聚半乳糖醛酸酶（PG），果膠甲基酯酶（PME），果膠裂解酶（PL）。果膠裂解酶（PL）是許多植物病原菌分泌的一種果膠酶，能降解植物細胞壁，許多病原真菌，卵菌，細菌在侵染過程都能分泌果膠裂解酶。果膠裂解酶因其在疫病致病過程中所起的重要作用而引起人們

3、的廣泛關注與研究，尤其是對其三維結構的研究。迄今為止在蛋白質數(shù)據庫（RSCB Protein Data Bank，PDB）上可以搜索到47個果膠裂解酶（Pectate lyase）相關的蛋白結構，可見對其結構的研究引起廣泛的興趣與關注。一個重要的原因在于果膠裂解酶基因（Pel）家族的龐大及催化機制的多樣性。
　　 果膠裂解酶作為重要的致病因子研究較多，而從致病菌（如辣椒疫霉菌）中克隆人們感興趣的有益基因為人們所用卻研究的較少。我

4、們的前期工作也是重點放在辣椒疫霉致病機理的研究上，2008年辣椒疫霉全基因組序列草圖的完成為我們更好的研究相關基因提供了條件。類單胺氧化酶C類脫水酶（MaoC-like dehydratase，MaoC）即是在對其全序列分析的基礎上獲得的一個有益基因。
　　 類單胺氧化酶C類脫水酶（MaoC-like dehydratase，MaoC）是最近被發(fā)現(xiàn)的一種新的乙酰輔酶A脫水酶（Enoyl-CoA hydratase），該酶在脂肪酸

5、的β-氧化到聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）的生化合成過程中提供（R）-專-的羥烷基輔酶A（R-3-hydroxyacyl-CoA）。MaoC已經被證明對于底物巴豆酰輔酶A（Crotonyl-CoA）具有烯醇基輔酶A水解酶（Enoyl-CoA）活性。MaoC因其乙酰輔酶A脫水酶（Enoyl-CoA hydratase）活性而成為與PHA合成相關的眾多酶類的一員。而PHA是一種可完全降解的物質，因而可用來

6、作為普通塑料的替代品，即PHA可以被用作綠色塑料。
　　 在我們的研究中，成功克隆了以上兩個重要功能基因果膠裂解酶基因（Pectate lyase，Pcpel2）及類單胺氧化酶C類脫水酶基因（MaoC-likedehydratase，MaoC）。對.Pcpel2分別進行了原核表達和真核表達，以期獲得高純度、高濃度蛋白用以進行蛋白晶體的生長。原核表達用到的載體分別有pET28a（+）、pET22b、pMa1等，用以篩選高效表達的重

7、組菌株；真核表達用的是pPIC9K載體，表達菌株是畢赤酵母GS115，用以篩選分泌型可溶蛋白。在純化過程中主要利用親和層析（6-HIS標簽）、陰陽離子交換層析及凝膠過濾層析純化方法，得到純蛋白后進行了晶體生長實驗，并最終生長出了晶體，但晶體質量有待優(yōu)化。
　　 對MaoC同樣進行了原核表達，對表達產物進行了親和層析和凝膠過濾層析純化，成功純化出了高濃度（5mg/ml）、高純度（95％以上）蛋白，進行晶體生長，并成功優(yōu)化出高質量蛋

8、白晶體。在X-Ray衍射下收集到一套較好衍射數(shù)據，并用分子置換方法解析出了MaoC蛋白晶體結構，分辨率達到1.93 A，晶胞參數(shù)為：a=81.458，b=82.614，c=124.228 A，α=β=γ=90°。對MaoC結構進行了相關生物信息學分析。并對MaoC酶活進行了測定，證實其對于底物巴豆酰輔酶A（Crotonyl-CoA）具有烯醇基輔酶A水解酶（Enoyl-CoA）活性，達到58.1U/㎎。MaoC因其乙酰輔酶A脫水酶（Eno