枳兩個(gè)基因PtrABF和PtrCDPK轉(zhuǎn)化枳的抗逆功能及其作用機(jī)制解析.pdf

1、柑橘在生長(zhǎng)發(fā)育的過程中易受到各種逆境脅迫，因此會(huì)對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生影響。為解決這些問題必須加強(qiáng)培育抗性強(qiáng)的柑橘品種。傳統(tǒng)的育種手段對(duì)于果樹育種來(lái)說，需要的周期長(zhǎng)，局限性較大，而隨著基因工程技術(shù)的應(yīng)用，將一些具有抗性的基因轉(zhuǎn)入柑橘中將加快柑橘育種的進(jìn)程。枳（Poncirus trifoliata）是柑橘中廣泛應(yīng)用的砧木之一，具有較強(qiáng)的抗寒性。已有研究表明，ABF和CDPK能被逆境誘導(dǎo)表達(dá)，參與逆境響應(yīng)調(diào)控。本研究利用超表達(dá)PtrABF和Ptr

2、CDPK早實(shí)枳，進(jìn)一步分析了它們的基因功能及其作用機(jī)理，研究結(jié)果如下:
　　1、對(duì)PtrABF基因轉(zhuǎn)早實(shí)枳株系進(jìn)行PCR鑒定，獲得6株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。PtrABF基因在＃8和＃10株系中超量表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系較野生型有較強(qiáng)的抗脫水能力。掃描電鏡觀測(cè)顯示轉(zhuǎn)基因植株的氣孔密度和開度較野生型降低。RT-PCR顯示氣孔發(fā)育相關(guān)基因SPCH、FAMA和MUTE在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量下降。PtrICE1是氣孔發(fā)育的關(guān)鍵基因，利用酵母

3、雙雜交和BiFC技術(shù)表明PtrABF能與PtrICE1互作。
　　對(duì)正常條件下的野生型和＃10系進(jìn)行基因芯片雜交，共挑選出70個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)42個(gè)，下調(diào)表達(dá)28個(gè)。隨機(jī)挑選了10個(gè)上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證與芯片結(jié)果一致。在上調(diào)表達(dá)的42個(gè)差異基因中，33個(gè)差異基因有功能注釋。并分析了33個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異基因的啟動(dòng)子中的ABREs(ABA-responsive elements)和CEs(coupling e

4、lements)順式作用元件。33個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異基因中，大部分啟動(dòng)子中僅包括ABREs、CEs或二者的組合式順式作用元件，只有5個(gè)不含有ABREs或CEs順式作用元件。
　　基因芯片分析顯示，PtPOD和PtADC的轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)基因系（＃10和＃8）中表達(dá)高于野生型(WT)。酵母單雜交和瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了PtrABF能與PtADC和PtPOD啟動(dòng)子互作。轉(zhuǎn)基因系中POD酶活性在脫水處理前后是野生型的大約2倍，脫水處理后，在轉(zhuǎn)基

5、因株系中POD、CAT、SOD酶活性均高于野生型，此結(jié)果與其基因表達(dá)量一致。ROS結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因葉片中H2O2和O2-的含量均顯著低于野生型，與DAB和NBT的染色結(jié)果一致。此外，轉(zhuǎn)基因系中MDA含量顯著低于野生型，與較低ROS積累結(jié)果一致。正常生長(zhǎng)條件下的轉(zhuǎn)基因系中的自由態(tài)多胺（腐胺、精胺、亞精胺）均高于野生型。不同濃度的D-arg(ADC抑制劑)預(yù)處理轉(zhuǎn)基因株系，脫水處理后，轉(zhuǎn)基因株系中H2O2和O2-的積累和含量隨著D-arg濃度

6、的增加而增加。不同濃度的雙胍辛胺乙酸鹽預(yù)處理后再進(jìn)行脫水處理，結(jié)果顯示，隨著雙胍辛胺乙酸鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因系中H2O2的積累較野生型少，且轉(zhuǎn)基因株系中抗氧化物酶的基因表達(dá)和酶活性也比野生型降低。
　　2、PtrCDPK編碼一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，開放讀碼框含有1676bp堿基，編碼558個(gè)氨基酸，該蛋白的分子量為63.25 kDa，等電點(diǎn)為8.26。PtrCDPK的催化區(qū)含有1個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)合區(qū)和調(diào)控區(qū)含有4個(gè)

7、EF手型結(jié)構(gòu)鈣結(jié)合區(qū)，氨基酸比對(duì)顯示與其他物種的相似性較高。與擬南芥CDPK家族進(jìn)行進(jìn)化樹分析顯示PtrCDPK被劃分為第Ⅲ族成員。PtrCDPK能響應(yīng)多種脅迫如ABA、干旱、鹽等，并定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。對(duì)PtrCDPK基因轉(zhuǎn)早實(shí)枳株系進(jìn)行PCR鑒定，獲得4株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。PtrCDPK基因在＃34和＃36株系中超量表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物具有較強(qiáng)的抗脫水能力，轉(zhuǎn)基因植物的相對(duì)失水率、電導(dǎo)率、MDA含量均低于野生型。轉(zhuǎn)基因株系積累較少的R