19813.枳和柑橘microrna及其靶基因的識(shí)別、鑒定與表達(dá)分析

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文枳和柑橘micrNA及其靶基因的識(shí)別、鑒定與表達(dá)分析姓名：宋長(zhǎng)年申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：房經(jīng)貴201106枳和柑橘IIlicr0RNA及其靶基因的識(shí)別、鑒定與表達(dá)分析列的表達(dá)結(jié)果表明利用這種有效的新的方法驗(yàn)證了枳中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的9個(gè)Ⅱ1iIⅢ缸的精確序列用和枳中相同的引物llliRRACE可以驗(yàn)證葡萄和蘋果生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的精確的序列。這種方法可以克服生物信息學(xué)法預(yù)測(cè)nliRNA的的主要缺點(diǎn)不能確

2、定IIli砌悄在前體上的精確序列，可能是lni砒蛆研究非常有用的工具。3用Solexa深度測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在枳中新的micr0鼢艙。從枳花芽、花以及不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)構(gòu)建的小RNA文庫(kù)中，總的13，106，753序列代表4，876，395獨(dú)立的序列被克隆測(cè)序。基于IIli心忱相似性序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，從克隆測(cè)序的156，639序列中發(fā)現(xiàn)63個(gè)血RNA屬于42個(gè)高度保守的miRNA家族，與已知miRNA的完全匹配我們還從枳中發(fā)現(xiàn)10個(gè)新的mi

3、I礬As，其前體從柑橘的560，271條EST中被確定，而且其中的5個(gè)mi砒叮A其miRNA也被克隆和測(cè)序。此外，定量RTPCR研究了這10個(gè)新的候選的IIliRNA表達(dá)在枳不同發(fā)育時(shí)期不同組織基因的表達(dá)。對(duì)大多數(shù)保守的和新的IIliI蝌A潛在的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，其中4個(gè)靶基因，包括一個(gè)編碼銅離子結(jié)合胚原酶的Ⅱixl2基因扣另外3個(gè)編碼NBLRR類抗病蛋白的基因在轉(zhuǎn)錄水平上受miNRAs調(diào)控。對(duì)枳花和果小RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)10個(gè)新的miIⅢ

4、A和42高度保守的mi鼢忱家族，這表明特異的刪A在枳中存在4為了研究枳在生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期miI礬A及其靶基因的表達(dá)特性，利用生物信息學(xué)方法和RACE技術(shù)從枳的不同發(fā)育時(shí)期根、莖、葉、花、果等不同器官構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中克隆了9個(gè)IIli鼢認(rèn)的10個(gè)靶基因的全長(zhǎng)，采用熒光定量IⅫPCR以及PPMRAcE和RLMRACE方法分析13個(gè)miRNA及其靶基因和miRNAs剪切靶基因產(chǎn)物(5’端和3’端)在枳葉(直徑大小分別是02，05和1cm)、幼

5、莖、老莖、根、花芽、花和果(直徑大小分別是o5，15，和2cm)等15種不同器官中的表達(dá)水平。結(jié)果表明枳nli對(duì)蛆和其靶基因在枳不同發(fā)育時(shí)期的不同器官中存在著相互消長(zhǎng)的關(guān)系，在枳的組織發(fā)育和成熟過(guò)程中nli鼢愴含量逐漸降低，而它的靶基因的含量逐漸上升。5利用InjRI認(rèn)CE鑒定了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的9個(gè)寬皮橘和15個(gè)甜橙礎(chǔ)鼢擒精確序列。采用熒光定量I汀PCR方法分析了這些nli№及其靶基因分別在寬皮橘和甜橙的幼莖、成熟莖、老莖、幼葉、成熟葉

6、、老葉、花芽、花蕾、花和果(花后15天，花后45天，花后75天，花后105天，花后145天)等14種不同器官中的表達(dá)水平用一種新的rniRNA介導(dǎo)的靶基因檢測(cè)剪切片段的方法PPMRACE和RLMRACE驗(yàn)證了mi鼢法潛在的靶基因。PPMRACE和I也M—RACE不但可以驗(yàn)證靶基因的剪切位點(diǎn)，而且能夠檢測(cè)剪切片段的表達(dá)模式從而知道m(xù)iRNA與靶基因的作用方式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miRNA在發(fā)育轉(zhuǎn)變、花的發(fā)育以及果實(shí)的成熟等多以切割靶基因模式來(lái)調(diào)