中間錦雞兒MicroRNA發(fā)現(xiàn)及其目標(biāo)基因鑒定與表達(dá)研究.pdf

1、中間錦雞兒（Caragana intermedia）系豆科錦雞兒屬落葉灌木，廣泛分布于我國黃河流域以北的干燥地區(qū)，是恢復(fù)植被、重建生態(tài)、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益俱佳的樹種。植物MicroRNA(miRNA)是廣泛分布于植物基因組中的長度在19-25nt的內(nèi)源非編碼smallRNA，在植物生長發(fā)育和響應(yīng)外界脅迫過程中起著重要的調(diào)控作用。在重要生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種上開展miRNA及其目標(biāo)基因的研究，可從miRNA角度解釋更多的重要生命現(xiàn)象，達(dá)到有效調(diào)控與

2、利用重要功能基因的目的。本研究采用高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法，鑒定中間錦雞兒miRNAs及其目標(biāo)基因，并應(yīng)用qRT-PCR和5'RACE技術(shù)對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;利用qRT-PCR技術(shù)在中間錦雞兒中開展系統(tǒng)的內(nèi)參基因篩選工作;進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)分析miRNAs及其目標(biāo)基因在不同發(fā)育階段不同器官和鹽脅迫條件下的表達(dá)。主要結(jié)果如下:
　　 (1)應(yīng)用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)3個(gè)small RNA文庫（中間錦雞兒幼年期、成

3、年期營養(yǎng)器官和成年期生殖器官）進(jìn)行測(cè)序，分別產(chǎn)生了24，543，122、20，179，252和20，209，482條原始序列;經(jīng)過去除低質(zhì)量序列、接頭序列和小于18nt的序列，3個(gè)small RNA文庫分別獲得24，147，728、19，748，030和19，762，567條序列;其中比對(duì)到植物已知miRNAs的序列分別為4，956，618(20.53％)、1，181，916(5.98％)和1，623，033(8.21％)條;未被注釋的

4、序列所占比例最大，分別為18，477，635(76.52％)、17，446，062(88.34％)和17，005，152(86.05％)，表明中間錦雞兒中還有很多miRNAs有待發(fā)現(xiàn)。
　　 (2)分析small RNA序列，鑒定出了中間錦雞兒160個(gè)保守miRNAs，屬于40個(gè)miRNAs家族，并發(fā)現(xiàn)了16個(gè)新的miRNAs;進(jìn)一步應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)14個(gè)保守miRNAs和2個(gè)新發(fā)現(xiàn)miRNAs進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證;結(jié)果表明高

5、通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析是鑒定保守miRNAs和發(fā)現(xiàn)新miRNAs行之有效的方法。
　　 (3)利用生物信息學(xué)的方法，預(yù)測(cè)出了45個(gè)miRNA目標(biāo)基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因多為轉(zhuǎn)錄因子，在植物組織器官形成、發(fā)育階段轉(zhuǎn)變和響應(yīng)外界環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮著重要作用;利用5'ACE技術(shù)驗(yàn)證了5個(gè)miRNA目標(biāo)基因，發(fā)現(xiàn)剪切位點(diǎn)多偏離第10與11個(gè)堿基位置。
　　 (4)利用qRT-PCR技術(shù)，系統(tǒng)的進(jìn)行了中間錦

6、雞兒內(nèi)參基因的篩選。結(jié)果表明UNK2、SAND、PP2A和EF-1a可作為不同發(fā)育階段不同器官中基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因;UNK2和SAND可作為鹽脅迫下，根和葉中基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因;UNK1、UNK2和PP2A可作為滲透脅迫下，根中基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因;TIP41和PP2A可作為滲透脅迫下，葉中基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因;SAND和EF-1a可作為低溫脅迫條件下，葉中基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因;SAND、PP2A和TIP41可作為高溫脅迫

7、下，葉中基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。
　　 (5)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)11個(gè)miRNAs及其目標(biāo)基因在不同發(fā)育階段不同器官中進(jìn)行表達(dá)分析，其中10個(gè)miRNAs在成年期營養(yǎng)器官中強(qiáng)烈表達(dá);1個(gè)miRNA(cin-miR157a)在幼年期和成年期生殖器官中強(qiáng)烈表達(dá)，在成年期營養(yǎng)器官中弱表達(dá)。除cin-miR159a的目標(biāo)基因MYB和cin-miR165a的目標(biāo)基因HD-ZIPⅢ外，其它被檢測(cè)的miRNAs目標(biāo)基因與相應(yīng)的miRNA

8、s的表達(dá)呈現(xiàn)出相互消長的表達(dá)模式。該結(jié)果表明miRNAs通過調(diào)控其目標(biāo)基因的表達(dá)，在中間錦雞兒生長發(fā)育過程中起著重要調(diào)控作用。
　　 (6)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)11個(gè)miRNAs及其目標(biāo)基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，其中7個(gè)miRNAs在鹽脅迫處理后，其表達(dá)量出現(xiàn)升高現(xiàn)象;1個(gè)miRNA(cin-miR398a)在鹽脅迫處理后表達(dá)量迅速下降。除cin-miR159a的目標(biāo)基因MYB外，其它被檢測(cè)的miRNAs目標(biāo)基因與

9、相應(yīng)的miRNAs的表達(dá)呈現(xiàn)出相互消長的表達(dá)模式。結(jié)果表明中間錦雞兒可通過提高miRNAs的表達(dá)量，進(jìn)而抑制其相應(yīng)目標(biāo)基因（多是生長發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá);或降低miRNAs的表達(dá)量，進(jìn)而減輕對(duì)其相應(yīng)目標(biāo)基因（與脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的基因）的抑制，從而適應(yīng)不利的外界環(huán)境條件變化。
　　 綜上所述，本研究鑒定出了中間錦雞兒160個(gè)保守miRNAs和16個(gè)新miRNAs，預(yù)測(cè)出了45個(gè)miRNA目標(biāo)基因;為中間錦雞兒不同發(fā)育階段和不