中間錦雞兒油酸脫氫酶(FAD2)基因克隆及酵母表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、中間錦雞兒（Caragana intermedia）廣泛分布于我國(guó)西部、西北部干旱地區(qū)，具有改良土壤和保持水土等重要生態(tài)價(jià)值。為了在兼顧生態(tài)價(jià)值的同時(shí)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，結(jié)合中間錦雞兒種子油脂含量較高的特點(diǎn)，對(duì)其脂肪酸生物合成進(jìn)行研究，探討內(nèi)在的調(diào)控機(jī)理，對(duì)培育抗寒性強(qiáng)、油脂品質(zhì)高的錦雞兒優(yōu)良新品種具有重要的意義和價(jià)值。本研究采用RT-PCR和RACE方法從中間錦雞兒未成熟種子中克隆了多不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶——油酸脫氫酶（FAD2）

2、基因；采用 DNAMAN、DNAStar軟件及http://www.us.expasy.Org、http://www.ch.embnet.org等網(wǎng)絡(luò)資源分析了4個(gè)FAD2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征、蛋白質(zhì)修飾等生物學(xué)特性；通過定量PCR的方法研究了FAD2基因在組織中的表達(dá)譜，并將3個(gè)FAD2基因轉(zhuǎn)化酵母，從mRNA、蛋白、產(chǎn)物三個(gè)水平對(duì)其進(jìn)行表達(dá)、調(diào)控分析，初步探討了其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)理。主要研究結(jié)果如下：
　　1.從中間錦雞兒未成熟種子

3、中克隆了3個(gè)Δ12脂肪酸脫氫酶基因，分別命名為FAD2-2A、FAD2-1A和FAD2-1B(GenBank No. EF503621、EU433557、EU433558)。對(duì)這三個(gè)基因以及本實(shí)驗(yàn)室前期研究過的中間錦雞兒CaFAD2基因（GenBank No. AY957394，本文中命名為FAD2-2B）進(jìn)行同源性比較分析可知，F(xiàn)AD2-1A與FAD2-1B同源性很高，F(xiàn)AD2-1A編碼的前283個(gè)氨基酸與FAD2-1B蛋白的同源性高

4、達(dá)98.9％，前者比后者多編碼97個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)基因編碼氨基酸的同源性為70.71%。FAD2-2A與FAD2-2B的氨基酸序列同源性也較高，為81.6%。FAD2-2B與FAD2-1A的氨基酸序列同源性最低，為64.7%。
　　2.生物信息學(xué)分析表明，4個(gè)蛋白中只有FAD2-2B有信號(hào)肽，其余3個(gè)都沒有信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)FAD2-2A與FAD2-1A相似，以無規(guī)卷曲為主，含少量直鏈，間或有α螺旋；FAD2-2B與FAD2-

5、1B相似，主要以無規(guī)卷曲和直鏈為主。4個(gè)蛋白是典型的膜結(jié)合蛋白，都有5~6個(gè)跨膜疏水區(qū)。在蛋白的穩(wěn)定性方面，F(xiàn)AD2-2A蛋白半衰期是220h，其余的半衰期僅30h或31h；在蛋白翻譯相對(duì)效率方面，F(xiàn)AD2-2B為1，其余3個(gè)均為5。FAD2-1A、FAD2-1B、FAD2-2A和FAD2-2B四個(gè)蛋白的棕櫚酰化位點(diǎn)分別是5、4、8和9個(gè)。
　　3、Southern檢測(cè)結(jié)果表明，在中間錦雞兒基因組中FAD2基因至少有4個(gè)拷貝。FA

6、D2-2A、FAD2-1A、FAD2-1B三個(gè)基因的熒光定量PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)AD2-2A基因在根和發(fā)育中期、后期種子中低水平表達(dá)，在幼嫩的莖、葉以及發(fā)育早期的種子中高水平表達(dá)。FAD2-1A基因在根中的表達(dá)量最低，在種子發(fā)育早期、中期大量表達(dá)，在幼嫩葉子中表達(dá)水平也較高。FAD2-1B基因僅在種子發(fā)育中期大量表達(dá)，別的組織、發(fā)育階段表達(dá)量都保持在本底水平。在不同組織以及種子的不同發(fā)育時(shí)期，F(xiàn)AD2-1A表達(dá)量的變化幅度最大，達(dá)到了近1

7、00倍，F(xiàn)AD2-1B次之，F(xiàn)AD2-2A的變化幅度最小。結(jié)合序列比對(duì)分析我們推斷：FAD2-2A基因可能主要負(fù)責(zé)合成膜脂中亞油酸，F(xiàn)AD2-1A主要負(fù)責(zé)種子及葉子貯脂中亞油酸的合成，F(xiàn)AD2-1B負(fù)責(zé)種子貯脂中油酸去飽和作用。
　　4、通過雙酶切將 FAD2-2A、FAD2-1A和FAD2-1B三個(gè)基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2中轉(zhuǎn)化酵母。20℃誘導(dǎo)表達(dá)菌株樣品的定量PCR、SDS-PAGE以及脂肪酸含量三個(gè)層次的分析可見，F(xiàn)

8、AD2-2A基因在誘導(dǎo)表達(dá)的前期轉(zhuǎn)錄水平迅速增加，后期表達(dá)量保持平穩(wěn)，蛋白質(zhì)、產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)一致；FAD2-1A基因表達(dá)的3個(gè)層次上的變化趨勢(shì)也一樣，都是表達(dá)量逐漸升高，且升高速度在整個(gè)過程中比較均衡；FAD2-1B的三個(gè)表達(dá)層次都表現(xiàn)出初期少量表達(dá)，中期表達(dá)量迅速增加的趨勢(shì)。
　　5、進(jìn)行15℃低溫處理后，F(xiàn)AD2-2A、FAD2-1A表達(dá)量在三個(gè)層次都有明顯升高，F(xiàn)AD2-1A的升高幅度比FAD2-2A小；FAD2-1

9、B轉(zhuǎn)錄水平略有升高，但蛋白和產(chǎn)物水平都沒有明顯變化。在受到高溫脅迫時(shí)，F(xiàn)AD2-2A、FAD2-1A基因表達(dá)在三個(gè)層次都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，F(xiàn)AD2-1B轉(zhuǎn)錄水平和產(chǎn)物水平都是先升高后降低，但蛋白水平無明顯變化。
　　6、三個(gè)處理溫度下基因表達(dá)三個(gè)層次的分析表明，F(xiàn)AD2-2A、FAD2-1A在各處理?xiàng)l件下的表達(dá)調(diào)控可能主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)。FAD2-1B基因在20℃條件下主要是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，在低溫條件下可能是通過轉(zhuǎn)錄和

10、翻譯調(diào)控來共同實(shí)現(xiàn)的，而高溫條件下可能是通過轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后三個(gè)層次進(jìn)行調(diào)控的。
　　7、在溫度條件變化時(shí)，F(xiàn)AD2-2A基因感應(yīng)外界條件變化的速度最快，最先出現(xiàn)表達(dá)量的變化，F(xiàn)AD2-1A次之，F(xiàn)AD2-1B最慢。
　　本研究全面、完整的闡述了FAD2-2A、FAD2-1A和FAD2-1B3個(gè)基因的表達(dá)規(guī)律，揭示了這三個(gè)基因內(nèi)在的調(diào)控機(jī)理，為進(jìn)一步開展中間錦雞兒種子油脂品質(zhì)的定向遺傳改良，培育適合生物柴油等各種化工生產(chǎn)