甘藍型油菜油脂QTL定位及油酸脫氫酶FAD2基因的克隆和分子進化.pdf

1、油菜是我國主要的油料作物之一，在我國的種植面積和總產量均居世界首位。含油量高低和脂肪酸組分比例是衡量油菜油脂品質的重要指標。我國油菜油脂品質改良始于上世紀80年代，經歷了從低(無)芥酸育種向脂肪酸組分精細改良育種的發(fā)展過程，反應了人們生活水平的提高，對食用油健康要求的提高。因此，在雙低高產的基礎上提高含油量、油酸含量和降低亞麻酸含量，是我國油菜品質育種的重要目標，同時還可以增加油菜生產的附加值，提高人們種植油菜的積極性，滿足人們對油脂品

2、質要求的提升。
　　 本研究利用甘藍型油菜的重組自交系群體SWU-1和F2群體L426對油脂性狀進行QTL定位；通過對F2群體親本及群體中極端表型材料的FAD2基因進行PCR克隆并序列比對分析，開發(fā)了基因內部特異性PCR引物，CAPS標記和絕對熒光定量引物；并利用不同物種FAD2基因的全長mRNA編碼序列對其進行生物信息學和分子進化研究，以期為油菜高含油量和優(yōu)良脂肪酸組分配比育種研究提供一定的理論基礎。本研究所完成的工作和取得的

3、主要結果如下：
　　 (1)以甘藍型黃籽高芥酸油菜GH06為母本，甘藍型黑籽雙低油菜P174為父本的重組自交系第八代的183個株系構成作圖群體，采用SSR、SRAP、AFLP、TRAP四種分子標記構建遺傳圖譜SWU-1，通過連續(xù)兩年的田間試驗對含油量、蛋白質和脂肪酸組分進行性狀分析和QTL定位研究。
　　 SWU-1群體的含油量和蛋白質含量呈單峰連續(xù)分布，且符合正態(tài)分布，是多基因控制的數(shù)量性狀。棕櫚酸含量，油酸含量，亞油

4、酸含量，亞麻酸含量呈正向偏離正態(tài)分布，廿碳烯酸含量和芥酸含量呈負向偏離正態(tài)分布。種子含油量、蛋白質含量呈顯著負相關，種子含油量、蛋白質含量與脂肪酸組分的相關性以及各脂肪酸組分之間的相關性在年度間基本一致。
　　 SWU-1遺傳圖譜是在本工程中心已構建的遺傳圖譜的基礎上增加分子標記，共得到595個有多態(tài)性的位點。在LOD=10.0時，共有451個標記進入連鎖群，包含200個SSR標記，199個SRAP標記，106個AFLP標記，7

5、個TRAP標記，圖譜總長1587cM，平均間距3.51cM。通過比較作圖分析確定了16個連鎖群，命名為N1～N18。有3個連鎖群(N9，N14，N19)因不能找到相對應的共有標記而不能確定連鎖群編號，以及N2(N18)和N1(N11)分布有兩個連鎖群標記。
　　 采用復合區(qū)間作圖法進行QTL分析，取LOD臨界值為2.5，檢測到兩個年份一共有8個含油量QTL和40個脂肪酸組分QTL，主要分布在N1，N8和N13三個連鎖群上，具有成

6、簇分布的特點。含油量的QTL分布在N1，N3，N4，N5，N7，N8和N13，單個位點解釋其變異的5.19％～13.57％；只有一個蛋白質的QTL，可解釋蛋白質表型變異的12.73％，位于N8連鎖群。
　　 與棕櫚酸含量相關的主效QTL位于N8和N13，單個位點解釋其變異的10.13％～34.79％，一個微效QTL位于N18，解釋表型變異4.71％；與油酸含量相關的主效QTL位于N8和N13，單個位點解釋其變異的7.95％～25

7、.42％，兩個微效QTL位于N13和N10，單個QTL分別解釋表型變異的7.68％和5.42％；與亞油酸含量相關的主效QTL位于N8和N13，單個位點解釋其變異的12.1％～22.92％，三個微效QTL位于N5，N13和N12，單個QTL分別解釋表型變異的7.8％，5.63％和4.28％；6個與亞麻酸有關的QTL位點，分別位于N4，N5，N7，N8，N10和N15，單個QTL分別解釋表型變異在4.95％～11.69％之間；與廿碳烯酸含量

8、相關的QTL位點位于N8，N11，N13和N18，單個QTL可解釋其表型變異的4.36％～13.47％；與芥酸含量相關的兩個主效QTL位點位于N8和N13，單個QTL可解釋芥酸含量表型變異的30.52％～43.76％，加性效應都來自于GH06。
　　 (2)以高油酸低亞麻酸(C18:1=87.22％，C18:3=1.94％)黑籽雙低油菜10L422為父本與中油酸高亞麻酸(C18:1=47.47％，C18:3=16.58％)黃籽雙

9、低油菜10L421為母本雜交構建了F2群體，利用SSR標記構建了F2群體A01連鎖群的局部遺傳圖譜，通過復合區(qū)間作圖分析，只檢測到一個與亞麻酸含量相關的QTL，解釋其表型變異的15.03％，LOD值為3.08，加性效應為1.36，來自于父本10L422。油酸含量，亞油酸含量，亞麻酸含量表現(xiàn)出單峰連續(xù)分布，呈多基因控制的遺傳特點；廿碳烯酸含量和硬脂酸含量呈負向偏離正態(tài)分布。油酸與其他脂肪酸呈極顯著負相關。
　　 (3)對F2群體親

10、本的FAD2基因進行PCR克隆及序列比對分析，發(fā)現(xiàn)FAD2基因的主要存在兩種類型的拷貝(BnFAD2-a和BnFAD2-b)，長度分別為1155bp和1141bp，BnFAD2-a是可正常表達的FAD2基因序列；BnFAD2-b在164bp～238bp之間存在間斷地14bp堿基的缺失，并存在7個提前終止的密碼子。
　　 根據(jù)這兩種類型序列的差異片段設計了基因內部特異性PCR引物，對F2群體中高油酸低亞麻酸材料和低油酸高亞麻酸材料

11、同時進行擴增，發(fā)現(xiàn)部分引物在油酸含量大于85％，亞麻酸含量低于4％的材料中是特異性擴增的。根據(jù)BnFAD2-a部分序列735bp處存在GCGC酶切位點，可以被HhaI限制性內切酶酶切產生預期大小的多態(tài)性片段，以鑒別BnFAD2-a中的不同類型的拷貝。
　　 采用絕對定量的熒光定量PCR方法分析了(BnFAD2-a和BnFAD2-b)兩種類型的序列在親本及群體極端表型的材料中的拷貝數(shù)。在群體材料中，1155bp長度的序列拷貝數(shù)大于

12、1141bp長度的序列拷貝數(shù)，1141bp長度的序列在高油酸親本中的拷貝數(shù)大于低油酸親本，據(jù)此我們推測可能是在高油酸的材料中某個有功能的拷貝(1155bp)由于同源重組被無功能的拷貝(1141bp)所置換，導致BnFAD2-b拷貝大量存在，使FAD2基因總的酶活力降低。
　　 (4)對32個物種49條FAD2基因的全長mRNA編碼區(qū)的核苷酸序列及其氨基酸序列進行比較分析，發(fā)現(xiàn)各物種之間的FAD2基因序列具有較高的相似性；從系統(tǒng)進