甘藍(lán)型油菜BnFUL和BnSHP的克隆及轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、油菜是重要的油料作物，收獲前和收獲時(shí)的裂果現(xiàn)象給生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。本論文首先通過(guò)生物信息學(xué)蛋白序列比對(duì)方法，尋找甘藍(lán)型油菜與開(kāi)裂相關(guān)的基因，進(jìn)一步克隆了2個(gè)基因組基因以及1個(gè)基因的片段，并進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)分析。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建載體，建立和優(yōu)化油菜遺傳體系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因工作，并對(duì)獲得的擬轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了初步的分子鑒定。獲得以下主要結(jié)果：
　　 1.通過(guò)與十字花科擬南芥果實(shí)開(kāi)裂基因的核苷酸序列及其氨基酸序相比較，發(fā)現(xiàn)油菜BnFUL、BnSHP

2、1、BnSHP2與擬南芥AtFUL、AtSHP1、AtSHP2的相似度分別高達(dá)93％、92％、92％；PFAM軟件分析表明，可能與油菜果實(shí)開(kāi)裂相關(guān)基因都有一個(gè)約50個(gè)AA的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，這與擬南芥是相同的。因此我們預(yù)測(cè)BnFUL、BnSHP1、BnSHP2可能調(diào)控油菜果實(shí)開(kāi)裂的過(guò)程。
　　 2.以油菜基因組DNA為模板，克隆并測(cè)定了BnSHP1、BnSHP2的編碼區(qū)序列。結(jié)果表明：BnSHP1基因編碼區(qū)長(zhǎng)達(dá)2756

3、 bp，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子；BnSHP2基因編碼區(qū)長(zhǎng)達(dá)3238bp，有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。
　　 3.通過(guò)RT-PCR對(duì)BnFUL、BnSHP1、BnSHP2時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，BnFUL在植物各個(gè)器官中廣泛表達(dá)，BnSHP1、BnSHP2有相似的表達(dá)模式，主要在花和果實(shí)中表達(dá)；BnSHP2在莖、葉、花序軸均沒(méi)有表達(dá)，而B(niǎo)nSHP1在莖中有微量得表達(dá)，葉和花序軸中沒(méi)有表達(dá)。
　　 為了確認(rèn)油菜開(kāi)裂基因

4、的功能，我們利用中間表達(dá)載體pSK和植物雙元表達(dá)載體pCanG，構(gòu)建了BnFUL超表達(dá)、BnSHP2 RNA干涉植物表達(dá)載體，并將它們成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。
　　 通過(guò)對(duì)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化多種因素的比較和探索，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系。采用甘藍(lán)型油菜從子葉節(jié)處切開(kāi)的帶柄子葉為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌感染10～30 min，共培養(yǎng)48 h，在含卡那霉素（Kan）8～10 mg/L和氨芐青霉素（Amp）100 mg/L的

5、培養(yǎng)基上篩選得到轉(zhuǎn)化體。以BnFUL超表達(dá)、BnSHP2 RNA干涉植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)卡那霉素篩選，BnFUL和BnSHP2轉(zhuǎn)化分別獲得48和15株抗性再生植株，以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPT Ⅱ的引物對(duì)抗性植株基因組DNA進(jìn)行了PCR檢測(cè)，BnFUL和BnSHP2分別有3和2株P(guān)CR檢測(cè)為陽(yáng)性。BnFUL超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率為0.18％；BnSHP2干涉載體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率為0.12％。
　　 本研究為