甘藍(lán)型油菜抗旱相關(guān)基因的克隆與表達(dá).pdf

1、本研究選用十字花科植物中耐旱性較強(qiáng)的推廣品種-甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)"滬油15"為模式油菜材料,在生理生化和分子水平上研究油菜適應(yīng)滲透脅迫的機(jī)理.為了克隆RD22相似基因,本研究對(duì)油菜幼苗進(jìn)行干旱處理后抽提總RNA,采用RT-PCR策略,克隆了油菜中的一個(gè)包含BURP區(qū)域蛋白的新基因:BnBDC1(Genbank accession number AY293830).該基因包含四個(gè)區(qū)域:N-端疏水區(qū)、短保守區(qū)、典型重

2、復(fù)區(qū)和C-端BURP區(qū).BnBDC1與擬南芥中脫水反應(yīng)基因RD22高度相似,與來(lái)自于油菜的BNM2基因?qū)儆谕粋€(gè)基因家族.Nothem Blot和半定量RT-PCR分析顯示,BnBDC1在油菜莖葉中組成性表達(dá),但在根中卻檢測(cè)不到其表達(dá),表明該基因是組織特異性表達(dá)的.BnBDC1的轉(zhuǎn)錄被甘露醇、鹽和ABA(脫落酸)正調(diào)節(jié),被紫外輻射和水楊酸負(fù)調(diào)節(jié),對(duì)H<,2>O<,2>和冷處理不敏感.通過(guò)干旱處理和RT-PCR策略,我們第一次從油菜中克隆

3、到細(xì)胞分裂原激活的蛋白激酶.該基因被命名為BnMPK3(GeneBank accession number AY642433),包含一個(gè)磷酸化位點(diǎn)(TEY)和一個(gè)位于C-端延伸區(qū)的保守的CD區(qū).BnMPK3與擬南芥MPK3基因高度相似,屬于MAPK家族中的A亞族.半定量PCR分析顯示,BnMPK3受甘露醇、鹽、冷、ABA(abscisic acid)、SA(salicylic acid)和m-JA(methyl jasmonate)誘導(dǎo)

4、.但SA和m-JA處理20分鐘后誘導(dǎo)BnMPK3表達(dá)后,持續(xù)保持高水平的表達(dá),而甘露醇、鹽、雙氧水和脫落酸等在短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)BnMPK3表達(dá)后,一般在1-2h就達(dá)到轉(zhuǎn)錄的最高峰.冷處理的滯后性分析顯示,BnMPK3的表達(dá)是在從正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)移到4℃后1h才啟動(dòng)表達(dá),在24h后達(dá)到最高峰.MAPK活性抑制劑PD98059和U0126不能抑制BnMPK3的轉(zhuǎn)錄.當(dāng)將BnMPK3克隆進(jìn)pYES2.1-TOPO載體,轉(zhuǎn)化酵母菌株后,將酵母菌株置

5、于600 mM甘露醇和0.2 mM tBuOOH的平板上生長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)超表達(dá)BnMPK3增強(qiáng)了酵母抵抗甘露醇和過(guò)氧化物的能力.我們的數(shù)據(jù)顯示BnMPK3是一個(gè)早期表達(dá)基因,涉及植物的生物和非生物脅迫.通過(guò)干旱處理和RT-PCR策略,我們第一次從油菜中克隆到細(xì)胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶,該基因被命名為BnMKK1,全長(zhǎng)cDNA為1,419 bp,包含由323個(gè)氨基酸組成的完整閱讀框,與AtMKK2有極高相似性(90﹪),在第222和229氨