甘藍型油菜“蜀雜九號”防御素基因全長cDNA的克隆與原核表達.pdf

1、本實驗根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登記的十字花科植物防御素基因序列，運用Primer5.0軟件設(shè)計了兩個引物5’-GCGGAATTCATGGCTAAGTTTGCTTCC-‘3和5'-CGCTCTAGATTAACATGGGAAATAACAGATAC-‘3，并為后插入到改造自Pharmacia公司的pGEX-2T克隆表達載體GTK中而加入了EcoRI和XbaI的酶切位點(粗體部分)。從正在萌發(fā)的甘藍型油菜“蜀雜九號”的種子提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄

2、為cDNA。并以此為模板進行PCR擴增，成功地從甘藍型油菜中克隆出長243bp編碼80個氨基酸的防御素基因的cDNA序列。　　將所得甘藍型油菜防御素基因的cDNA片段插入到pGEX-2T表達載體GTK的EcoRI和XbaI多克隆位點之間。將重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21的感受態(tài)細胞中，獲得了表達甘藍型油菜防御素基因的重組子。在2×YTA培養(yǎng)基中，通過0.1mM的IPTG誘導(dǎo)，18℃培養(yǎng)2h，經(jīng)SDS-PAGE分析，獲得了與

3、理論值相符合的34KD的融合蛋白。而且經(jīng)Western-blot進一步檢測，證明了融合蛋白的表達?！　≡谌诤系鞍椎某醪郊兓邪l(fā)現(xiàn)：不論是改變IPTG濃度還是降低培養(yǎng)溫度，融合蛋白均以不溶性的包涵體形式存在。所以選擇對細胞毒副作用小的0.1mM的IPTG和相對表達量多的誘導(dǎo)溫度18℃作為純化條件。超聲波破碎菌體分離包涵體，并洗滌和用含8M的尿素的緩沖液來溶解包涵體。為進一步純化甘藍型油菜防御素蛋白奠定了基礎(chǔ)，也為以后研究防御素基因調(diào)控機