甘藍型油菜隱性核不育基因Bnms1的精細定位和克隆.pdf

1、雜種優(yōu)勢利用是提高油菜產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的有效途徑。雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢利用主要的途徑，但是對于雄性不育機理的研究卻遠遠滯后。甘藍型油菜細胞核雄性不育(GMS)敗育徹底，不育性表現(xiàn)穩(wěn)定，細胞質(zhì)來源豐富，恢復源廣泛，在國內(nèi)已成為油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一。S45AB來源于四川大學，由潘濤等(1988)在Oro中發(fā)現(xiàn)的自然突變體衍生而來，經(jīng)過多代的兄妹交(25代以上)保存，通過雜交試驗證明S45A的不育性受兩對重疊隱性基因控制(潘濤等，

2、1988)。在近等基因系S45AB中，一個不育位點處于雜合狀態(tài)，另外一個不育位點處于隱性純合狀態(tài)。本研究以S45AB作為基礎(chǔ)材料，對處于雜合狀態(tài)的隱性核不育基因進行了遺傳定位和克隆的研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.3年的育性調(diào)查結(jié)果表明：兄妹交后代的育性分離比穩(wěn)定在1∶1，可育株自交后代的育性比例符合3∶1。這一結(jié)果進一步證實了在兩型系S45AB中控制育性的兩個位點中只有一個處于分離狀態(tài)，我們將這個位點的不育基因命名為Bnms1

3、；另外一個位點處于隱性純合狀態(tài)，不育基因命名為Bnms2。
　　 2.半薄切片觀察發(fā)現(xiàn)可育花藥和不育花藥在減數(shù)分裂前沒有明顯差異。四分體時期四分體沒有明顯差異，不育花藥的絨氈層比可育花藥的稍厚。在單核花粉期小孢子差異明顯，不育小孢子沒有花粉外壁的合成，發(fā)育長時間停留在單核花粉期并最終解體；不育花藥的絨氈層表現(xiàn)為徑向擴大，液泡化明顯。S45A敗育發(fā)生的關(guān)鍵時期在四分體至單核花粉期，絨氈層異常、花粉外壁的缺失是導致敗育的主要原因。<

4、br>　　 3.應(yīng)用AFLP與BSA結(jié)合的方法分析近等基因系S45AB，共篩選了2560對AFLP引物組合，獲得7個與目的基因(Bnms1)連鎖的AFLP標記AF1-AF7。用包含310個單株的近等基因系群體將Bnms1基因定位在標記AF3和AF7之間，標記與基因間的遺傳距離分別為1.6cM和0.3cM，標記AF1和AF2與基因共分離。
　　 4.回收、克隆了以上7個AFLP特異片段，測序結(jié)果表明AF1-AF7的精確長度分別為

5、203bp、241bp、211bp、186bp、187bp、284bp和362bp。通過PCR-walking分離AFLP標記的側(cè)翼序列，將AF1、AF3、AF6和AF7分別延長至7,499bp、997bp、1,203bp和656bp，并轉(zhuǎn)化為4個SCAR標記SC1、SC3和SC6和SC7。用1,974個單株的S45AB近等基因系將Bnms1基因定位在標記SC1和SC7之間，標記與Bnms1基因間的遺傳距離分別為0.1cM和0.3cM。

6、
　　 5.利用DH群體(Zhongyou821×Bao604)為作圖群體，構(gòu)建了一張包含237個標記的遺傳圖譜，圖譜總長1,625.6cM，包括2個RFLP標記，65個RAPD標記，86個SSR標記，84個SRAP標記。利用兩個DH群體(Tapidor×Ningyou7、Zhongyou821×Bao604)的遺傳圖譜將不育基因Bnms1定位于N7連鎖群，并在N7連鎖群上找到一個與Bnms1基因連鎖的共顯性標記Na12A02，

7、Na12A02與基因的距離為2.6cM。
　　 6.以分子標記SC7、SC1和SC6的特異片段為探針篩選Tapidor BAC文庫，得到41個陽性克隆。利用標記SC1和SC7將Bnms1基因定位在BAC克隆BAC1上，對克隆BAC1進行shotgun測序?；贐AC序列開發(fā)了6個新標記SC8-SC13，在4132個單株群體中Bnms1基因被定位在標記SC8和SC11之間，標記與Bnms1基因間的遺傳距離分別為0.05cM和0.1

8、5cM，SC8和SC11在BAC克隆BAC1上的物理距離為21.2-kb。
　　 7.用21.2-kb的序列檢索GenBank的EST數(shù)據(jù)庫和擬南芥數(shù)據(jù)庫(AGIGenes)，結(jié)果表明該區(qū)域存在四個候選基因，四個候選基因在甘藍型油菜上的排列順序與擬南芥基因的排列順序一致。第一個和第四個候選基因是功能未知的基因，第二個候選基因?qū)儆贜AP類型基因，第三個候選基因是CYP450基因家族成員，分析認為第二和第三個候選基因可能與花粉發(fā)育相

9、關(guān)，以下用G14、G15表示。
　　 8.Northern blot分析表明G14和G15的表達量在S45A和S45B之間沒有明顯差異。在小于1mm、1mm～2mm、2mm～3mm和3mm～4mm四種大小的花蕾之間G14的表達量沒有變化，表達水平很低；G15在1mm～2mm、2mm～3mm大小的的花蕾中特異表達。
　　 9.比較測序發(fā)現(xiàn)，G14在S45A和S45B之間存在2個錯義突變，導致第79位的纈氨酸突變?yōu)楸彼?；?/p>