甘藍(lán)型油菜S45AB隱性細(xì)胞核雄性不育表達(dá)譜的研究.pdf

1、甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育(GMS)敗育徹底,不育性表現(xiàn)穩(wěn)定,細(xì)胞質(zhì)來(lái)源豐富,恢復(fù)源廣泛,己成為我國(guó)油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑之一。甘藍(lán)型油菜近等基因系(NIL)S45AB只在育性控制位點(diǎn)上Bnms1/BnMs1存在差異。以S45AB作為基礎(chǔ)材料,利用半薄切片技術(shù)比較了S45AB花藥的顯微結(jié)構(gòu),利用差減文庫(kù)和基因芯片技術(shù)分析了S45AB花蕾轉(zhuǎn)錄譜的表達(dá)差異,并通過(guò)差異表達(dá)基因的功能分析,推理了可能導(dǎo)致S45A花粉敗育的代謝過(guò)程。主要結(jié)果如

2、下:
　　 半薄切片觀察發(fā)現(xiàn):在減數(shù)分裂前,不育材料S45A與可育材料S45B花藥沒(méi)有明顯差異；至四分體時(shí)期,不育花藥的絨氈層比可育花藥的體積增大并排列緊密；在單核花粉期,S45A中小孢子沒(méi)有花粉外壁的形成,小孢子切片呈光滑的圓形,發(fā)育長(zhǎng)時(shí)間停留在小孢子單核期,同時(shí),S45A中絨氈層繼續(xù)惡化,液泡化明顯,并最終解體。而在S45B中,由于小孢子表面外壁的存在,小孢子切片呈現(xiàn)出不規(guī)則四邊形,小孢子發(fā)育為成熟的花粉粒。S45A敗育發(fā)生

3、的開(kāi)始時(shí)期為四分體至小孢子單核期,絨氈層異常是引起敗育的主要因?yàn)椤?br>　　 利用SSH構(gòu)建了正向差減文庫(kù)(富集了可育材料中上調(diào)表達(dá)的基因)和反向差減文庫(kù)(富集了不育材料中上調(diào)表達(dá)的基因)兩個(gè)文庫(kù),每個(gè)文庫(kù)包含1536個(gè)克隆。對(duì)兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行了反向Northern blot篩選,并且對(duì)正向文庫(kù)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行了測(cè)序,發(fā)現(xiàn)這些克隆代表了71個(gè)基因,其中有4條基因,分別為At1g30330,At1g71170,At5g10400,At5g5

4、2160在擬南芥花蕾中特異或相對(duì)大量表達(dá)。
　　 利用Affymatrix公司的擬南芥寡核苷酸芯片,對(duì)S45AB花蕾之間的表達(dá)差異進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)在S45B中有69條上調(diào)表達(dá)的基因,在S45A中有46條上調(diào)表達(dá)的基因。根據(jù)MIPS A.thaliana Genome Database提供的信息對(duì)這些基因,包括差減文庫(kù)獲得的和芯片篩選得的所有在S45B中上調(diào)表達(dá)的基因進(jìn)行了功能歸類。結(jié)果表明,這些基因可分為18大類,包括參與代謝、

5、蛋白命運(yùn)決定、蛋白結(jié)合功能、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、環(huán)境互作、亞細(xì)胞定位的相關(guān)基因和未知功能基因,分別占了28.60％、12.20％、36.80％、11.40％、13.10％、41.80％和17.20％,參與代謝調(diào)節(jié)的基因很少,只占1.63％。對(duì)25個(gè)在S45B上調(diào)表達(dá)的基因和5個(gè)在S45A中上調(diào)表達(dá)的基因進(jìn)行了Real-timePCR驗(yàn)證,Real-time PCR結(jié)果證實(shí)芯片的結(jié)果真實(shí)可靠,并根據(jù)他們表達(dá)模式的差異,將在S45B中上調(diào)表達(dá)的23個(gè)

6、基因分成三類,對(duì)第一類基因做了功能分析,發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因,At3g06860、At3g51590、At4g00040和At5g48880參與了脂肪酸代謝途徑,并且推測(cè)可能是絨氈層中脂肪酸代謝紊亂致使孢粉素合成受阻從而導(dǎo)致了S45A的小孢子敗育。
　　 根據(jù)Real-time PCR結(jié)果,比較了擬南芥花藥發(fā)育的關(guān)鍵基因,A6、CALS5、DEX1、MYB103、MS1、MS2和NEF1在S45AB花蕾中的表達(dá)模式,比較了各擬南芥突變體