甘藍型油菜突變體Cr3529抑制性反向消減文庫的構建和BnCr4基因全長cDNA的克隆.pdf

1、為了探究黃化性狀突變的分子機理，本實驗應用抑制性消減雜交(SSH)技術構建了甘藍型油菜幼葉黃化突變體Cr3529的抑制性反向消減文庫。經(jīng)菌落PCR檢測，反向消減文庫的有效重組率為76.5％，其中插入的cDNA片段大小在100bp到1000bp之間。再通過斑點雜交對100個隨機挑選的含有插入片段的陽性克隆進行初步地差異篩選，得到差異比較明顯的克隆的比率為75％。隨機選取36個陽性克隆進行序列測定。用DNAssist序列分析軟件對測序結果分

2、析比較，cDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較?！　∫愿仕{型油菜(Brassicanapus)幼葉黃化突變體Cr3529的幼葉為材料提取RNA，在已經(jīng)構建的油菜幼葉黃化突變體Cr3529反向消減文庫中選取一個已經(jīng)測序的編碼未知功能蛋白質(zhì)的基因片段，設計特異引物并應用逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成和Race-PCR技術，克隆得到該基因片段的cDNA全序列，命名為BnCr4。序列分析表明，該基因cDNA的開放閱讀框為1395bp，編碼46

3、5個氨基酸。對推測的BnCr4氨基酸序列的組成、同源性、物理和化學性質(zhì)進行了分析。發(fā)現(xiàn)推測的BnCr4氨基酸序列與擬南芥中一個功能未知的蛋白質(zhì)有較高的同源性(81％)。隨后又對該基因編碼蛋白的二硫鍵的形成、親水性以及二級結構和三級結構進行了初步地預測。大致將它的氨基酸序列分為三個結構域，靠近5’端的約110個氨基酸主要以無規(guī)則卷曲為主，含有較多的β-轉(zhuǎn)角；中段的約240個氨基酸二級結構比較豐富，可能在功能上有重要作用；而靠近3’端的約1