甘藍(lán)型油菜菌核病抗性相關(guān)基因cDNA文庫構(gòu)建及評(píng)價(jià).pdf

1、菌核病是油菜生產(chǎn)上重要病害之一，目前還沒有完全抗病的品種，品種間只存在耐病程度的不同。從分子水平上了解油菜核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)侵染前后的反應(yīng)，有利于菌核病抗性機(jī)理的研究。該文利用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)富集菌核病抗性相關(guān)基因片段的差減cDNA文庫，并用cDNA點(diǎn)陣膜雜交差示篩選技術(shù)、Northern雜交技術(shù)對(duì)文庫作鑒定，并對(duì)差異表達(dá)的ESTs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從防御反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和防御反應(yīng)探討油

2、菜抗菌核病的機(jī)理，篩選抗病相關(guān)基因。取得的主要研究結(jié)果如下： 1.對(duì)子葉接種后0h，4h，8h，12h，14h，16h，18h和24h菌絲侵染過程和發(fā)病情況進(jìn)行了觀察調(diào)查，處理14h后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，核盤菌菌絲已經(jīng)在葉肉組織內(nèi)開始擴(kuò)展，16h肉眼觀察到發(fā)病病斑，16h-20h病斑擴(kuò)展迅速，24h時(shí)病斑覆蓋到子葉1/2，確定了合適的取樣時(shí)間為接種后18h。 2.分別取接種核盤菌菌絲塊18h后的甘藍(lán)型油菜(寧RS-1)子

3、葉和用無菌水處理的健康子葉作為材料，提取mRNA，采用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)富集菌核病早期抗性相關(guān)基因片段的差減cDNA文庫。含1000個(gè)克隆，重組率為97％，插入片段大小約在300bp-900bp，平均大小為500-600bp。 3.接種核盤菌18h和無菌水處理18h的子葉總RNA做探針，與cDNA點(diǎn)陣膜雜交，檢測(cè)接種前后基因表達(dá)差異，推定抗病相關(guān)基因。發(fā)現(xiàn)85個(gè)非重復(fù)病原接種18h時(shí)信號(hào)增強(qiáng)的克隆，測(cè)序分析，獲得68個(gè)代

4、表不同油菜基因的EST序列，從其功能看，56個(gè)ESTs序列分屬于初級(jí)代謝、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、能量代謝、蛋白合成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抗病防御、信號(hào)傳導(dǎo)和次生代謝等生命過程，涉及到抗病反應(yīng)的基本過程，包括信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)基因、參與過敏反應(yīng)基因、病程相關(guān)蛋白基因，細(xì)胞保護(hù)和抗病防御有關(guān)代謝反應(yīng)酶基因等，12個(gè)基因片段在GenBank尚不能推斷其功能。 4.對(duì)cDNA點(diǎn)陣膜雜交差示篩選的8個(gè)信號(hào)增強(qiáng)的克隆進(jìn)行了Northern雜交驗(yàn)證和進(jìn)一步的表