甘藍(lán)型油菜BnMPK3抗菌核病功能研究.pdf

1、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）是我國主要的油料作物，而菌核?。⊿clertinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）是油菜的主要病害之一，也是限制油菜生產(chǎn)的重要因素，然而，人們對B. napus對S. sclerotiorum的抗病機(jī)制目前仍不甚了解，這大大限制了對該病的防治工作。
　　在對各種寄主和病原菌相互作用的研究中已經(jīng)顯示，植物絲裂原活化蛋白激酶類基因（mitogen-activated p

2、rotein kinase genes，MAPK），特別是MPK3，在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要的作用，目前，在模式植物擬南芥中，人們對AtMPK3的非生物抗逆及細(xì)菌病害的防衛(wèi)中的作用展開研究，然而在其它植物或農(nóng)業(yè)作物中，對于MPK3是否也參與寄主對S. sclerotiorum的防衛(wèi)作用及其機(jī)制仍未見研究或報(bào)道。
　　為了研究MPK3在油菜中抗菌核病的功能，本研究從B. napus中克隆了BnMPK3的全長cDNA。序列分析顯示，B

3、nMPK3編碼一個含有十一個保守基序和一個高度保守的TEY磷酸化位點(diǎn)的蛋白，并且這個蛋白在其 C-terminal extension含有CD錨定區(qū)域；誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，在油菜被菌核病侵染處理后，BnMPK3迅速出現(xiàn)顯著性的上調(diào)表達(dá)，而在信號分子的化學(xué)物質(zhì)甲基茉莉酸（MeJA）和乙烯前體（ACC）處理時，BnMPK3也發(fā)生顯著的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而，煙草葉片瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示BnMPK3蛋白定位于細(xì)胞核中。這些結(jié)果表明， BnMPK3是菌

4、核病侵染的顯著響應(yīng)基因，并且可能與茉莉酸和乙烯介導(dǎo)的防衛(wèi)信號途徑相關(guān)。
　　為了進(jìn)一步研究BnMPK3的抗菌核病功能，本研究構(gòu)建了用于過量表達(dá)BnMPK3基因的植物表達(dá)載體1300-35S-BnMPK3-NOS和用于抑制BnMPK3基因表達(dá)的載體PCXSN-BnMPK3-RNAi，并且使用In planta Agrobacterium-mediated transformation方法轉(zhuǎn)化油菜。經(jīng)抗生素篩選和PCR檢測，共鑒定出1

5、8個獨(dú)立的過量表達(dá)轉(zhuǎn)化株系和11個抑制表達(dá)轉(zhuǎn)化株系，用qRT-PCR表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)分別鑒定得到6個BnMPK3表達(dá)量顯著上升或下降的轉(zhuǎn)化株系，分別選擇其中3個株系進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　抗病鑒定實(shí)驗(yàn)顯示，BnMPK3過量表達(dá)油菜轉(zhuǎn)化株系明顯提高了對菌核病的抗性，而其抑制表達(dá)轉(zhuǎn)化株系顯著降低了對菌核病的抗性。使用qRT-PCR的表達(dá)分析顯示，當(dāng)BnMPK3過量表達(dá)時，茉莉酸防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)志基因BnPDF1.2和乙烯防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)志基因BnEIN

6、3和BnACS等顯著上調(diào)表達(dá)，而傷誘導(dǎo)途徑標(biāo)志基因BnJR1和BnVSP1發(fā)生下調(diào)，臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)顯示，S. sclerotiorum侵染時， BnMPK3的過表達(dá)植株中細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡明顯減輕。這些結(jié)果表明，BnMPK3在油菜抗菌核病分子機(jī)制中起著重要作用。本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步建議BnMPK3的抗菌核病功能可能是通過多重機(jī)制來起作用的：即當(dāng)S. sclerotiorum侵染油菜時，BnMPK3通過激活乙烯途徑，抑制傷誘導(dǎo)途徑和細(xì)胞死亡