菌核病菌誘導甘藍型油菜差異表達Rsk基因的初步分析.pdf

1、本文以抗(耐)菌核病顯著強于中油821的中R-888作供體親本，中油821作受體親本和回交親本所創(chuàng)建的甘藍型油菜近等基因系為材料，克隆了菌核病菌誘導差異表達基因的全長，分析了近等基因系之間在不同生長時期以及不同部位間該基因的表達。主要結(jié)果如下： 篩選并初步鑒定了采用cDNA-AFLP方法分離出的與抗菌核病相關(guān)的差異表達片段40-2。對其進行BLAST序事列比對分析，推測其基因表達產(chǎn)物屬于富含亮氨酸蛋白重復家族。利用RT-RACE

2、方法對有效差異片段40-2進行全長cDNA擴增，得到總長為1707bp的cDNA序列，包含有完整的Polv(A)尾巴結(jié)構(gòu)和5'端的非翻譯區(qū)。登錄Genbank，注冊號DQ983911。 通過BLASTx序列比對分析該序列與擬南芥中的抗病/富含亮氨酸重復的蛋白質(zhì)家族的mRNA同源性最高達87％，序列相似性分析還發(fā)現(xiàn)其基因表達產(chǎn)物與擬南芥中一個與蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)的激酶有很高的同源性達62％，并且該cDNA序列具有保守的LRR-RI區(qū)域

3、，推測其有可能是核糖核酸酶抑制子亞家族成員。目前在油菜中還未發(fā)現(xiàn)與該序列同源的基因與蛋白質(zhì)。推測其有可能是油菜中的一個與抗病相關(guān)的LRR蛋白質(zhì)家族成員。 以中油821基因組為模板，根據(jù)差異片段40-2全長cDNA序列設(shè)計一對引物進行PCR擴增，得到40-2基因組DNA全長。測序結(jié)果表明該基因組DNA全長1685bp，預測為一個基因，編碼區(qū)在264-1586bp之間，具有一個外顯子，沒有內(nèi)含子。登陸GenBank，注冊該基因名字為

4、Rsk(Sclertiorum Resistanct Kinase gene)，登錄號為DQ983911。 它的開放閱讀框在264bp-1586bp，長度達1323bp，編碼一個由440個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。編碼的蛋白質(zhì)在GenBank上的登錄號為ABl99471，它包含了20種常見的氨基酸，其中亮氨酸含量最多。該蛋白分子量為48.308KD，等電點為5.35，為一個酸性蛋白質(zhì)。其蛋白質(zhì)兩端具有親水性，中間具有疏水性，含有一

5、個跨膜結(jié)構(gòu)域。二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)含有最多的是隨機卷曲(Random coil)結(jié)構(gòu)，其次是a-螺旋(Alpha helix)和延伸鏈(Extended strand)結(jié)構(gòu)。在290-313的氨基酸殘基處具有一個LRR結(jié)構(gòu)域，在蛋白質(zhì)接近C-端處具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，C-端末尾部分位于細胞溶質(zhì)內(nèi)。從其結(jié)構(gòu)特征推測，該蛋白可能定位于細胞膜上。 以中油821×中R888 BC<,5>的基因組DNA為模板，同樣條件擴增的產(chǎn)物測序結(jié)果

6、表明該基因組DNA全長1703bp，基因組DNA序列預測為一個基因，編碼區(qū)在264-1604bp之間，具有一個外顯子，沒有內(nèi)含子。登陸GenBank，獲得登陸號為EF623492。比對分析結(jié)果顯示，在中油821×中R-888 BC<,5>中擴增的：DNA序列的1-1577、1596-1703處都能與中油821中的Rsk基因序列重合，但是在第1573-1595位的18個堿基在中油821中的Rsk基因中是缺失的。即在中油821中克隆的Rsk

7、基因全長與中油821×中R-888 BC5中克隆出的對應基因的全長相比，前者缺失了18個堿基。推測在基因水平上的堿基缺失差異很有可能與近等基因系之間的抗(耐)菌核病的差異有關(guān)。中油821×中R-888 BC<,5>中克隆的基因序列推測編碼446個氨基酸殘基，從N端開始到438以及兩者最后的兩個氨基酸都是相同的，中油821×中R-888 BC5在439-444處多出6個氨基酸，其余部分完全重合。該結(jié)果與DNA)芋列的比對結(jié)果相吻合。推測它