菌核病菌誘導甘藍型油菜抗病基因表達差異的分析.pdf

1、本實驗以抗(耐)菌核病顯著差異的甘藍型油菜近等基因系(甘藍型油菜中油821(輪回親本)和中R888×中油821的回交5代所組成的一對近等基因系)為材料，利用cDNA-AFLP技術尋找菌核病菌誘導后所產(chǎn)生的表達差異，篩選并初步鑒定了與抗菌核病相關的差異片斷，為油菜抗菌核病防御反應機理的研究提供線索。本實驗取得的主要結果如下： 建立了用10×8.5cm小型垂直板電泳展示選擇性擴增產(chǎn)物的體系。在43℃條件下，用小面積變性聚丙烯胺凝膠檢

2、測擴增產(chǎn)物，使AFLP更為簡便、經(jīng)濟，而亦可檢測到可靠、豐富的多態(tài)位點。這將推進AFLP技術更迅速進入一般實驗室。用cDNA-AFLP技術方法分析了甘藍型油菜近等基因系受菌核病菌侵染后特異表達條帶。對獲得的20個差異片斷進行了驗證，得到9個有效片斷，并克隆測序，對測序的結果進行序列相似性分析。并從中選擇兩條序列片斷進行了分析。 由差異片段40-2的比對分析結果推測，其基因表達產(chǎn)物屬于富含亮氨酸蛋白家族。同源片段克隆得到40-2的

3、延伸序列片斷，在近等基因系中都含有大小相同的帶型。選擇蛋白質(zhì)延伸因子-1α作為內(nèi)參照，進行半定量PCR結果顯示所得序列在近等基因系之間有明顯的模板量差異，即在輪回親本中油821中表達量明顯較大，在回交后代中表達量相對較少。Northern雜交的結果驗證該基因片斷在甘藍型油菜抗(耐)菌核病菌材料中低水平表達，在感病材料中呈高水平表達，說明該片斷與甘藍型油菜抗(耐)菌核病有關。 對差異片斷18-2進行同源片段克隆得到長度約為1260

4、bp左右的延伸序列。ORFfinder推測該序列包含有一個完整的開放閱讀框架，經(jīng)BLAST序列比對分析，該片斷與擬南芥中一未知功能蛋白高度同源。在進行同源性分析后發(fā)現(xiàn)此序列在近等基因系之間的同源性僅為89.9％；酶切位點的分析發(fā)現(xiàn)，MseI(在進行cDNA-AFLP分析時用EcoRI/MseI限制性內(nèi)切酶組合分別進行酶切近等基因系的cDNA)酶切位點發(fā)生的缺失在回交后代中，而中油821中存在此酶切位點。Northern雜交的結果卻發(fā)現(xiàn)在