組織和發(fā)育特異性表達(dá)抗病雙基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜及其抗病性研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)采用了in planta轉(zhuǎn)化方法,將外源基因?qū)胫杏?21、寧RS-1、湘油13三種甘藍(lán)型油菜品種中,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T<,0>代和T<,1>代進(jìn)行了PCR,Southern blot,RT-PCR檢測(cè)證實(shí)了外源基因已經(jīng)導(dǎo)入并表達(dá).通過離體葉片接種和草酸毒素法鑒定轉(zhuǎn)基因植株對(duì)菌核病的抗(耐)性.實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下:1.構(gòu)建了植物表達(dá)載體ApSCO(LB-P<,SAG12>-pr16-chil3b-tnos-P<,SAG12>-oxo-

2、tnos-pnos-nptII-tnos-RB).2.應(yīng)用in planta轉(zhuǎn)化方法,將質(zhì)粒ApSCO轉(zhuǎn)化中油821、寧RS-1、湘油13和華雙3號(hào)四種甘藍(lán)型油菜品種,除華雙3號(hào)由于收獲種子較少未獲得PCR陽(yáng)性植株外,其余3個(gè)品種均獲得了轉(zhuǎn)基因植株,轉(zhuǎn)化效率在0.1﹪左右.各甘藍(lán)型油菜品種間的轉(zhuǎn)化效率無明顯差異.這種方法方便、快速且無須經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得上百株轉(zhuǎn)基因植株.該方法的成功為建立更高效的甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因方法以及開展甘藍(lán)型

3、油菜的功能基因組研究打下了基礎(chǔ).3.PCR和Southern-blot檢測(cè)證明外源基因已經(jīng)導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜并整合于油菜的染色體中.4.離體葉片接種結(jié)果:轉(zhuǎn)基因植株T1代19個(gè)株系的病情指數(shù)小于70﹪,轉(zhuǎn)基因植株各株系的平均病斑直徑最小的N1為1.32±0.345cm比對(duì)照小1.25cm.5.不同時(shí)期離體葉片接種結(jié)果:衰老葉片比幼嫩葉片接種后的病斑擴(kuò)展速率平均小0.93cm,擴(kuò)展速率差值最大的Z10-15為1.33cm.衰老葉片比幼嫩葉片接

4、種后的病斑直徑平均小0.64cm,病斑直徑差值最大的N1-7為0.96cm.這表明外援基因確實(shí)在轉(zhuǎn)基因植株的衰老葉片中表達(dá)了,并且在衰老葉片中的表達(dá)量高于在幼嫩葉片中的表達(dá)量,表現(xiàn)為表達(dá)的發(fā)育特異性.6.對(duì)Z6轉(zhuǎn)基因植株T1代進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,經(jīng)卡方檢測(cè)證明,陽(yáng)性和陰性比為3:1.說明外源基因已經(jīng)遺傳給后代,并符合孟德爾遺傳規(guī)律.7.草酸毒素法檢測(cè)結(jié)果與離體葉片接種結(jié)果成正相關(guān),轉(zhuǎn)基因植株T1代19個(gè)株系的毒素指數(shù)小于60﹪.由于草酸毒