鮭魚降鈣素轉(zhuǎn)基因油菜的分子檢測和抗病性研究.pdf

1、本文以鮭魚降鈣素轉(zhuǎn)基因油菜為試材，對轉(zhuǎn)基因油菜油體中表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行了分子檢測和抗病性研究，目的在于：(1)檢測鮭魚降鈣素基因是否整合到油菜基因組中，在油菜油體中是否表達(dá)，明確其表達(dá)量；(2)初步研究鮭魚降鈣素外源基因的導(dǎo)入對油菜抗病性的影響。(3)克隆可使降鈣素酰胺化的大鼠酰胺化酶基因，提高降鈣素在植物中的生物學(xué)活性；(4)構(gòu)建大鼠酰胺化酶的植物油體表達(dá)載體，探討其在植物油體表達(dá)體系中的表達(dá)情況。 具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：(

2、1)通過PCR、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western分析對鮭魚降鈣素的轉(zhuǎn)基因油菜株系進(jìn)行了分子檢測，證明鮭魚降鈣素基因已整合到油菜基因組中并在油菜油體中表達(dá)。(2)利用凝膠成像中的定量分析軟件，對轉(zhuǎn)基因油菜中oleosin-msCT融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行了定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同轉(zhuǎn)基因油菜株系中目的蛋白的表達(dá)量差異很大，融合蛋白表達(dá)量占種子總重量從1.04‰到23.78‰不等。其中株系L45和L49中msCT表達(dá)量最高，分別占種子總重量的

3、2.96‰和3.96‰。(3)對鮭魚降鈣素轉(zhuǎn)基因油菜的抗病性研究發(fā)現(xiàn)：接種油菜菌核病和油菜蕪菁花葉病毒后，轉(zhuǎn)基因植株的抗病性較非轉(zhuǎn)基因略好，過氧化物酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等防御酶系的活性也較非轉(zhuǎn)基因略高。外源基因的導(dǎo)入對提高植物的抗病性可能有一定作用。(4)分離和克隆了擬南芥油體蛋白基因的啟動(dòng)子及編碼大豆24KD油體蛋白的結(jié)構(gòu)基因；克隆了大鼠酰胺化酶氧化酶基因，將其插在大豆24KD油體蛋白基因的C端，構(gòu)建了以擬南芥油

4、體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的大豆油體蛋白-大鼠酰胺化酶氧化酶融合蛋白植物表達(dá)載體。大鼠酰胺化酶氧化酶基因在植物中的表達(dá)未見報(bào)道。 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)是：(1)明確了鮭魚降鈣素在植物油體體系中的表達(dá)情況，篩選得到了msCT高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因油菜純系。(2)發(fā)現(xiàn)鮭魚降鈣素外源基因整合到油菜基因組后對提高植物的抗病性有一定作用。(3)構(gòu)建了大鼠酰胺化酶氧化酶植物油體表達(dá)載體，首次利用植物油體表達(dá)體系表達(dá)大鼠酰胺化酶。(4)明確了msCT-大鼠酰胺化