西瓜、甜瓜遺傳化體系的建立及轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析.pdf

1、植物真菌病害一直是影響農(nóng)作物產(chǎn)量，降低農(nóng)作物品質(zhì)的主要原因，西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.)Mantsum.etNakai]和甜瓜(CucumismelonLinn.)是經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的水果，其栽培面積和產(chǎn)量我國在世界上均占首位，但其病害種類繁多，尤其以真菌性病害最為嚴(yán)重，是瓜類生產(chǎn)中存在的主要問題。在植物抗病基因工程中，通過將抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入植物來提高農(nóng)作物對(duì)真菌病害的抵抗能力已成為一種直接有效的方法，雖然植物抗

2、病基因工程在一些重要農(nóng)作物改良中取得了一定進(jìn)展，但是由于瓜類遺傳基礎(chǔ)狹窄、抗病種質(zhì)資源缺乏、抗病遺傳規(guī)律的復(fù)雜性和西瓜、甜瓜存在組培再生困難、試管苗移栽成活率低和遺傳轉(zhuǎn)化體系較難優(yōu)化等問題，使基因工程在瓜類作物的抗病遺傳育種應(yīng)用受到限制，因而這方面的應(yīng)用研究起步較慢。 我們系統(tǒng)研究了西瓜、甜瓜組織培養(yǎng)體系，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜、甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系.構(gòu)建了含有煙草的幾丁質(zhì)酶基因(CHI)和煙草β-1，3-葡聚糖酶基因(GLU)和小

3、麥的硫堇蛋白基因(THI)的三價(jià)抗真菌融合基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化西瓜、甜瓜，成功地獲得了9株轉(zhuǎn)基因甜瓜和7株轉(zhuǎn)基因甜瓜株系，并進(jìn)行了相關(guān)分子生物學(xué)鑒定，期望從中篩選出抗病性增強(qiáng)的品種來為常規(guī)育種提供材料，以求在生產(chǎn)上達(dá)到提高瓜類對(duì)真菌病害的抵抗能力。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1建立了高效西瓜、甜瓜組織培養(yǎng)體系①莖尖與子葉切塊可誘導(dǎo)分化不定芽，愈傷組織也可誘導(dǎo)不定芽分化，但頻率很低，真葉、下胚軸和莖段僅能誘導(dǎo)出愈傷組織。 ②建立了

4、以西瓜、甜瓜子葉塊為外植體的不定芽分化再生體系，其最適培養(yǎng)基分別為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L，在最適培養(yǎng)基上二者的不定芽誘導(dǎo)率分別可達(dá)91.2％和94.3％. ③一定濃度的6-BA是誘導(dǎo)瓜類子葉塊外植體分化的關(guān)鍵，基因型不同的誘導(dǎo)率不同，但對(duì)于瓜類不同品種而言，附加低濃度的IBA則有利于這種分化的發(fā)生，無激素培養(yǎng)基上的外植體則不能誘導(dǎo)出不定芽。

5、④無菌苗子葉顏色由黃色轉(zhuǎn)呈淺綠色時(shí)的子葉塊最適合于不定芽的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率最高。 ⑤西瓜、甜瓜再生植株生根較易，低濃度IBA(0.5mg/L)即可較好的誘導(dǎo)形態(tài)正常、有明顯根毛的不定根。NAA也能誘導(dǎo)西瓜生根，但對(duì)甜瓜效果很差。 2優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系①西瓜、甜瓜子葉塊外植體對(duì)卡那霉素非常敏感，卡那霉素對(duì)外植體的生長和分化有明顯的抑制作用，80mg/L是適宜的篩選壓力，頭孢霉素和氨芐青霉素在高濃度500mg/L時(shí)，對(duì)外

6、植體的生長分化無明顯影響，均可用于侵染后的脫菌和抑菌過程。 ②根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105比LBA4404對(duì)西瓜有較高的轉(zhuǎn)化率，對(duì)甜瓜轉(zhuǎn)化率差異不明顯。 ③預(yù)培養(yǎng)是獲得較高西瓜、甜瓜轉(zhuǎn)化率必要條件，共培養(yǎng)時(shí)間以3-4d為宜，菌液濃度OD600值在0.3-0.5左右時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，侵染時(shí)間以15-20min為最佳。乙酰丁香酮(AS)對(duì)西瓜、甜瓜的轉(zhuǎn)化效果不顯著。 3西瓜、甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化①抗真菌基因植物表達(dá)載體：構(gòu)建

7、了PNZIP::FG1植物表達(dá)載體：將35S::FG1表達(dá)載體中的35S啟動(dòng)子替換為PNZIP啟動(dòng)子。 ②利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將融合基因FG1轉(zhuǎn)入西瓜、甜瓜，共獲得16株轉(zhuǎn)基因植株。PCR鑒定和Nouthern雜交分析結(jié)果表明外源基因己成功整合到西瓜、甜瓜基因組中并得到表達(dá)。 ③對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行了抗病性檢測，采用離體葉片和田間接種灰霉、炭疽、和西瓜枯萎病菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因西瓜和甜瓜株系中，轉(zhuǎn)基因甜瓜和基因西瓜比對(duì)